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Investigating the expression of two protein kinase genes involved in the tomato immune response
Christine Maria Kraus
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Peter Schlögelhofer
DOI
10.25365/thesis.15787
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29694.42046.327269-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Bti9, ein putativer PAMP-Rezeptor aus Tomaten, besteht aus 3
extrazellulären LysM-Domänen, einer Transmembrandomäne und einer intrazellulären Serin / Threonin Kinase. Er wurde in einem “yeast two hybrid” Experiment gefunden, bei dem der durch das Typ 3 Sekretionssystem injizierte bakterielle Effektor AvrPtoB aus Pseudomonas syringae als Köder
eingesetzt wurde. Das am nächsten verwandte Homolog in Arabidopsis stellt CERK1 dar, welches den Chitinrezeptor kodiert. Aktivierung von CERK1 löst PAMP-induzierte Immunität aus; bei nichtfunktionalem CERK1 wird Chitin
nicht mehr als Reiz wahrgenommen. Im Gegensatz zu CERK1 wird Bti9 in zwei verschiedenen Formen exprimiert, die sich lediglich in ihrem ersten Exon unterscheiden. Das alternative erste Exon (Exon 1a) liegt ca. 2.5 kb oberhalb des zuerst beschriebenen (Exon 1b). Die beiden ersten Exons beinhalten
jeweils die kompletten 3 LysM Motive; in CERK1 bilden diese die Ligandenbindestelle. Dies könnte darauf hindeuten, dass sich die beiden Spliceformen in ihrer Bindungsspezifität unterscheiden. Für beide Spliceformen wurden ESTs in öffentlich zugänglichen Datenbanken gefunden, was darauf hindeutet, das beide in der Pflanze exprimiert werden. Aufgrund der Sequenzähnlichkeit zu CERK1 stellen wir die Hypothese auf, dass es sich bei Bti9 um einen PAMP-Rezeptor handeln könnte, möglicherweise einen Chitin-Rezeptor. Diese Arbeit konzentriert sich hauptsächlich auf die Charakterisierung der beiden Bti9 Spliceformen sowie ihrer
Expressionsmuster, transkriptionellen Regulation und möglichen Funktion als PAMP-Rezeptor. qRT-PCRs zeigen, dass beide Formen in der gesamten Pflanze exprimiert werden, sich aber in ihrer Expressionsstärke unterscheiden: während Bti9-Exon 1b deutlich exprimiert ist, sind die Mengen
an Bti9-Exon 1a sehr gering. Die Transkripte beider Spliceformen werden in Reaktion auf die Injektion von PAMPs oder lebenden Bakterien mit Hilfe von Spritzen hochreguliert. Allerdings ist auch als Antwort auf eine Schein-Infiltration mit Wasser eine Hochregulierung feststellbar, was darauf hindeutet, das es sich zumindest teilweise um eine Wundantwort handelt. Die Tatsache, dass die beiden Spliceformen zu sehr unterschiedlichen Zeiten ihre
maximalen Expressionen erreichen, deutet auf eine unterschiedliche Regulation hin, die möglicherweise in einer funktionalen Diversifikation begründet liegt. Transgene Tomaten, die Promotor-GUS Fusionen der beiden Spliceformen enthalten, wurden geschaffen, um eine detailliertere Analyse der Expressionsmuster zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden cerk1-2 Arabidopsis Linien generiert, die Proteine der beiden Spliceformen aus Tomaten herstellen; diese erlauben Komplementationsanalysen zur
experimentellen Überprüfung einer möglichen Funktion als Chitin Rezeptor.
Pto ist ein intensiv untersuchtes Resistenz-Gen aus Tomaten, das Resistenz gegen Pseudomonas Stämme vermittelt, die mindestens einen der beiden Effektoren AvrPto oder AvrPtoB herstellen. Bis jetzt ist noch wenig über sein Expressionsmuster in der Pflanze bekannt. Um dies zu untersuchen, wurden Konstrukte hergestellt, die den Pto Promotor zusammen mit einem GUS Reporter Gen enthalten, um in Tomaten transformiert werden zu können. Die
Funktionalität dieser Reporter wurde mit Hilfe transienter Proteinexpression in N. benthamiana bestätigt. Aufgrund der niedrigen Transformationseffizienz des Tomatenstamms Rio Grande ergab die Transformation lediglich eine transgene Linie, in der das Transgen offenbar inaktiv war. Zur Zeit wird das Reporter-Konstrukt in Moneymaker Tomaten transformiert, da diese bekanntermaßen leichter zu transformieren sind.
Abstract
(Englisch)
The tomato protein Bti9, a putative PRR with three extracellular LysM motifs, a transmembrane domain and an intercellular serine / threonine kinase domain, was discovered in a yeast two hybrid screen using the type III effector protein AvrPtoB from Pst as a bait. Bti9 is the closest known tomato
homologue to CERK1, the chitin receptor in Arabidopsis thaliana. Activation of CERK1 leads to elicitation of PTI; disruption of CERK1 abolishes recognition of chitin as a PAMP in Arabidopsis. In contrast to CERK1, Bti9 is expressed in
two forms, which differ only in the first exon. The alternative first exon (exon 1a) resides approx. 2.5kb upstream of the initially described transcriptional initiation site (exon 1b). The two first exons encode all 3 LysM motifs, which in CERK1 form the ligand binding site; this might mean that the splice forms have different binding characteristics. ESTs have been found for both in public databases, indicating their expression in planta. Due to the sequence similarity to CERK1, we hypothesized that Bti9 might function as a pattern recognition receptor (PRR) in tomato, potentially as chitin receptor. This thesis focuses primarily on the characterization of the Bti9 splice forms and their expression patterns, transcriptional regulation and potential function as a PRR. qRT-PCRs demonstrate that both splice forms are expressed throughout the plant, but in very different quantities: while Bti9 exon 1b is robustly expressed, expression levels of Bti9 exon 1a are very low. After syringe infiltration of PAMPs or living bacteria, both transcripts are strongly upregulated; however, as this induction is also induced by mock infiltration, it most likely results at least in part from a wounding response. The fact that the two splice forms peak at significantly different time points after induction indicates differential regulation, which might reflect functional diversification. Transgenic tomato lines carrying promoter GUS fusions for both splice forms
have been generated for a more detailed analysis of expression patterns. Furthermore, Arabidopsis cerk1-2 lines have been transformed with both Bti9 splice forms and will allow complementation assays to test a potential function
as chitin receptors.
Pto is an extensively investigated R-gene from tomato conferring resistance to Pst strains expressing the effectors AvrPto and / or AvrPtoB. Still it is little known about its expression pattern in planta. To address this, a Pto promoter
GUS construct was generated to be transformed into tomato. Expression of the reporter was confirmed by transient Agrobacterium mediated transformation of N. benthamiana. Because of the low transformation efficiency in Rio Grande, only one transgenic line resulted from the tomato transformation, in which the transgene was apparently silenced. The reporter construct is currently being transformed into Moneymaker tomatoes, as this strain is known to be more easily transformable.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
BTI9 CERK1 Tomato PAMPs PTI ETI Pseudomonas PTO
Schlagwörter
(Deutsch)
BTI9 CERK1 Tomate PAMPs PTI ETI Pseudomonas PTO
Autor*innen
Christine Maria Kraus
Haupttitel (Englisch)
Investigating the expression of two protein kinase genes involved in the tomato immune response
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung der Expression zweier Proteinkinase Gene mit Funktion in der Immunantwort in Tomate
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
111 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Peter Schlögelhofer
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.43 Pflanzengenetik
AC Nummer
AC09555761
Utheses ID
14171
Studienkennzahl
UA | 490 | | |