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Unraveling functions of the Arabidopsis histone deacetylase HDA6 in RNA-mediated silencing, DNA damage response and plant development
Franziska Stille
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Werner Aufsatz
DOI
10.25365/thesis.15830
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29648.68990.676265-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der reversible Prozess der posttranslationalen Histonmodifikationen ist ein wichtiger Mechanismus in der Regulation von Genexpression und Chromatinstruktur. Die Acetylierung der Histon „Tails“ wird durch die enzymatische Aktivität der Histonacetyltransferasen (HATs) katalysiert und korreliert mit transkriptionell aktivem Chromatin. Histondeacetylasen (HDACs) wirken der Acetylierung durch HATs reversibel entgegen und balancieren so den Acetylierungsstatus des Chromatins. Deacetylierte Histone werden mit transkriptionaler Genrepression und der Aufrechterhaltung von Heterochromatin assoziiert. In Pflanzen und anderen Eukaryoten wurde eine Vielzahl von HDACs identfiziert, welche eine wichtige Rolle im Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung haben. Genetische Screens haben die RPD3-verwandte Histondeacetylase HDA6 als einziges Enzym identifiziert, welches für den Deacetylierungschritt während der RNA-dirigierten DNA Methylierung (RdDM) verantwortlich ist. Dies legt den Schluss nahe, das HDA6 spezifische Funktionen für den Prozess der Genrepression mittels „small interfering RNAs“ (siRNAs) erworben hat. RdDM führt zur de novo Methylierung von Cytosinen in allen Sequenzkontexten innerhalb der zur siRNA homologen genomischen Sequenz. Diese Methylierung führt zur transkriptionellen Repression von Transgenen und endogenen Zielregionen. In einem aktuellen Modell sind die DNA Methylierung und die Histonacetylierung jeweils dem anderen vorgeschaltet, was zu einen „Feedback Loop“ führt. Hier werden beide epigentischen Modifikationen als mögliche Kontrollpunkte in der Regulation von aktivem und repressivem Chromatin gesehen. Bezugnehmend auf den funktionalen Zusammenhang zwischen DNA Methylierung und Histondeacetylierung wurden in dieser Arbeit die Funktion von HDA6 in der RNA-dirigierten Genrepression und die epigenetisch korrelierenden Phenotypen in der Abwesenheit von HDA6 analysiert. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von HDA6 Mutantenallelen (rts1-3, rts1-4 und rts1-5) charakterisiert, welche jeweils enzymatisch inaktive Proteine kodieren. Alle Allele, inklusive dem bereits beschriebenen rts1-1 Nullallel, zeigten keine schwerwiegenden Entwicklungsdefekte, sondern nur einen etwas retardierten Größenphenotyp gepaart mit einer verspäteten Blütezeit. Des Weiteren zeigten alle Mutanten eine drastische Reaktivierung des getesteten Transgenes sowie einiger endogenen RdDM Zielgene. Diese transkriptionelle Reaktivierung korrelierte mit der Zunahme von euchromatischer Histonacetylierung (H3K9/14ac2) sowie mit der Abnahme von repressiven Histonmethylierungen (H3K9me2, H3K27me1). Interessanterweise wurde für keines der getesteten Allele eine Abnahme der DNA Methylierung am soloLTR und, für 2 der 4 getesteten Allele, am transgenen NOSpro:NPTII festgestellt. Folglich scheint bei einigen Zielgenen DNA Methylierung von transkriptioneller Repression und von Histondeacetylierung unabhängig zu sein. Die beobachteten Phenotypen (transkriptionelle Reaktivierung, induzierte Histonacetylierung und reduzierte Histon K9 und K27 Di- bzw. Monomethylierung) konnten mittels Überexpression eines funktionalen HDA6 Alleles komplementiert werden. Daraus folgt, dass alle beobachteten Effekte auf einer Defizienz von HDA6 beruhen und dass HDA6 entweder nach der DNA Methylierung oder in einem parallelen Mechanismus agiert. Des Weiteren wurde der additive Effekt von artifiziell induzierter DNA Demethylierung auf die Reaktivierung von Zielgenen getestet. Es konnte eine bedeutsame Erhöhung der Trankriptionslevel gezeigt werden. Erstaunlicherweise wurde jedoch keine signifikante Veränderung des DNA Methylierungstatus beobachtet. In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Lysinacetylierung von Proteinkomplexen eine wichtige Rolle in verschieden zellulären Prozessen hat, wie z.B. im Reparaturprozess von DNA Defekten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass alle HDA6 Mutantenallele sensitiv auf Zebularin, einer Substanz die neben DNA Demethylierung auch DNA Defekte auslöst, reagieren. Daher wurde auch die Sensitivität des rts1-1 Nullallels auf weitere Substanzen, welche einen DNA Defekt induzieren, getestet. Tatsächlich konnte eine erhöhte Hypersensitivität gegenüber genotoxischem Stress beobachtet werden. Die Überexpression eines funktionalen HDA6 Alleles konnte diese Hypersensitivität allerdings komplementieren. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass HDA6 eine Doppelfunktion als „Wächter“ von sowohl epigenetischer Information und der Genomstabilität hat. Zusätzlich wurde der globale Effekt von HDA6 auf das Arabidopsis Transkriptom mittels Affymetrix ATH1 Microarrays getestet. Hier konnte gezeigt werden, dass HDA6 sowohl als transkriptioneller Aktivator wie auch als Repressor fungiert, da sowohl induzierte als auch unterdrückte Gene identifiziert wurden. Auch konnte gezeigt werden, dass HDA6 neben der Rolle als genereller transkriptioneller Regulator möglicherweise in weitere diverse Prozesse involviert ist, wie z.B. in der Antwort auf abiotische und biotische Stresse.
Abstract
(Englisch)
The reversible process of posttranslational histone modifications is an important mechanism of epigenetic regulation in the control of gene expression and chromatin structure. The acetylation of histone tails is catalyzed by the enzymatic activity of histone acetyltransferases (HATs) and is correlated with transcriptionally active chromatin. Histone deacetylases (HDACs) reversibly counteract HATs, thereby balancing the chromatin acetylation state. Deacetylated histones are therefore related with transcriptional gene silencing and maintenance of heterochromatin. A large number of HDACs have been identified in plants and other eukaryotes, and they were found to play crucial roles in plant growth and development. Genetic forward screens identified the RPD3-like histone deacetylase HDA6 as the sole enzyme responsible for the histone deacetylase step of RNA-directed DNA methylation (RdDM), suggesting that HDA6 might have acquired specific functions for transcriptional silencing processes mediated by small interfering RNAs (siRNAs). RdDM leads to de novo methylation of cytosine residues in all sequence contexts within a region of sequence homology to the siRNA trigger, causing transcriptional repression of a varity of transgenes and endogenous loci. A current model proposes that DNA methylation and histone acetylation are acting upstream of one another in a self-reinforcing pathway, thereby serving as control points for switching between the silenced and active states. Given this functional relationship between histone deacetylation and cytosine methylation during RdDM, the role of HDA6 in RNA silencing and epigenetic phenotypes upon HDA6 deficiency were investigated in this study. To this aim, a series of different allelic mutations in the Arabidopsis gene HDA6 (rts1-3, rts1-4 and rts1-5), all encoding enzymatically inactive proteins, were characterized. All alleles, including the previously described rts1-1 null allele, exhibit no severe developmental defect but showed a somewhat retarded growth phenotype and delayed flowering. Furthermore, HDA6 deficiency resulted in a drastic suppression of transcriptional gene silencing at investigated transgenic and endogenous loci. This transcriptional reactivation could be correlated with increased euchromatic acetylation marks (H3K9/14ac2) and decreased heterochromatic methylation marks (H3K9me2; H3K27me1). Interestingly, the release of silencing did not correlate with altered DNA methylation levels for all alleles at the soloLTR and, for 2 out of 4 alleles, at the transgenic NOSpro:NPTII. Therefore, it seems likely that DNA methylation is uncoupled from transcriptional silencing as well as from histone deacetylation at some loci. The observed phenotypes (transcriptional reactivation, increased histone acetylation and decreased histone K9 and K27 di- and monomethylation, respectively) were all complemented in rts1-1 mutant lines constitutively expressing a tagged and functional HDA6 allele. These results suggest that all observed effects are due to HDA6 deficiency and that HDA6 is either acting downstream of cytosine methylation or in a parallel silencing pathway. Furthermore, possible additive effects on transcription upon artificially induced DNA demethylation were investigated in this study. A significantly increased transcriptional reactivation compared to mock grown plants could be observed. Interestingly, however, DNA methylation levels were only affected to a minor extent. Lysine acetylation was shown to preferentially target protein complexes involved in diverse cellular processes, including the DNA damage response. Since HDA6 mutants are sensitive to zebularine, a DNA demethylating drug also known to induce DNA damage, rts1-1 sensitivity to different DNA damaging drugs was investigated in this study. An increased hypersensitivity to genotoxic stress was observed, which could be complemented by the expression of a tagged and functional HDA6 allele. This suggests that HDA6 has a dual role as a guardian of both, epigenetic information and genomic stability. Additionally, the influence of HDA6 on the Arabidopsis transcriptome was investigated using Affymetrix ATH1 microarrays. HDA6 could be shown to be both a transcriptional repressor and activator as both up- and downregulated genes were identified upon HDA6 deficiency. It remains to be determined, however, which of these transcriptional changes are direct consequences of the loss of HDA6 function. The analysis of the transcriptome profiling data further suggests diverse roles of HDA6 next to general transcriptional regulation, for example the involvement in responses to abiotic and biotic stresses.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
histone acetylation DNA methylation gene silencing DNA damage
Schlagwörter
(Deutsch)
Histone Acetylierung DNA Methylierung Genrepression DNA Defekte
Autor*innen
Franziska Stille
Haupttitel (Englisch)
Unraveling functions of the Arabidopsis histone deacetylase HDA6 in RNA-mediated silencing, DNA damage response and plant development
Paralleltitel (Deutsch)
Entschlüsselung der Arabidopsis Histon Deacetylase HDA6 Funktionen in der RNA-dirigierten Genexpression, der Reaktion auf DNA Defekte und in der Pflanzenentwicklung
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
132 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Ortrun Mittelsten Scheid ,
Leonie Ringrose
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08935175
Utheses ID
14207
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |