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The hetero-pentameric nicotinic acetylcholinereceptor in the spinal cord of mice
Florian Grössl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Petra Scholze
DOI
10.25365/thesis.15862
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29768.78366.152870-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Aktivierung des nikotinischen Azetylcholinrezeptors (nAChR) im Rückenmark (RM) kann, möglicherweise abhängig von der Konzentration des nikotinischen Agonisten, sowohl Analgesie als auch Hyperalgesie auslösen. RT-PCR Experimente haben bereits die Expression einer relativ großen Anzahl an Untereinheiten, und folglich auch Rezeptor – Subtypen, im Rückenmark von Ratten nahegelegt. Wir konnten im Rückenmark der Maus die Anwesenheit von mRNA‘s bestätigen, die für die Untereinheiten α2, α3, α4, α5, α6, β2 und β4 kodieren. Diese Diversität erlaubt prinzipiell eine große Anzahl an unterschiedlichen nAChR. Die Lokalisierung dieser Rezeptoren mit Hilfe von immunohistochemischer Färbung und Autoradiographie zeigte eine besonders hohe Dichte in dorsalen Bereichen der grauen Substanz, eine Region in der sensible Schmerzfasern synaptische Verbindungen mit Projektionsneuronen des Rückenmarks eingehen. Um die analgetischen und hyperalgetischen Eigenschaften nikotinischer Liganden einem bestimmten Typ von Rezeptor zuordnen zu können wurde in einem ersten Schritt die Komposition der Untereinheiten sowohl mit [³H]-Epibatidin Bindungsexperimenten als auch mit einfacher und sequentieller Immunpräzipitation (IP) bestimmt. Die in dieser Studie verwendeten selbst hergestellten polyklonalen (Hasen-) Antikörper sind gegen die zytoplasmatische Schleife gerichtet und wurden ausgiebig an in HEK293 Zellen exprimierten, rekombinanten Rezeptoren und Nervengewebe von Wild-Typ (WT) und – als negative Kontrolle - Knock-Out (KO) Mäusen getestet.
IP mit einer Kombination aus anti-β2 und anti-β4 Antikörpern im Rückenmark von C57BI/6J Mäusen ergab ein totale Konzentration von 43.7 ± 1.16 fmol/mg an Proteinbindungsstellen. Etwa 85% dieser Rezeptoren beinhalten die Untereinheiten α4 und β2, während die Assemblierung von α3 mit β4 10% aller Rezeptoren ausmachte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass α3 auch mit β2 (in Abwesenheit von β4) Rezeptoren in vivo ausbildet. Die Untereinheiten α2 und α5 konnten nur in sehr kleinen (2.5% und 2%) aber signifikanten Mengen nachgewiesen werden während keine α6- haltigen Rezeptoren detektiert wurden.
Diese Beobachtungen wurden durch Analyse der Untereinheitkombinationen von Mäusen mit gezielter Gendeletion der β2 und β4 Untereinheit unterstützt. Die Gesamtmenge der Rezeptoren im Rückenmark von β2 KO Mäusen war auf 10% und damit genau auf die Menge an β4 – Rezeptoren im WT, reduziert. Trotz dieses dramatischen Verlustes an Rezeptoren konnten wir keinerlei Kompensation durch andere Untereinheiten feststellen. Im Gegensatz dazu war die absolute Anzahl an Rezeptoren in β4 KO Mäusen im Vergleich zum WT praktisch unverändert.
Der Einsatz von KO – Mäusen erlaubte uns außerdem eine Berechnung der Bindungskinetik von [³H] – Epibatidin an definierten (aber nicht rekombinanten!) Rezeptoren mit Hilfe von Membranbindung. Aus diesen Untersuchungen ergab sich für den α3β4 – Rezeptor, analysiert in β2-KO Mäusen, ein Kd - Wert von 160 ± 24 pmol während die Affinität des α4β2 – Rezeptor (vorherrschend in WT-Mäusen) mit einem Kd – Wert von 53.7 ± 6 pmol dreimal so hoch war.
Insgesamt gesehen zeigen unsere Beobachtungen, dass das Rückenmark in Bezug auf den hetero-pentameren nAChR einen sehr heterogenen Bereich darstellt was die Suche nach einem rein analgetisch wirkenden Liganden zu einer anspruchsvollen Aufgabe macht.
Abstract
(Englisch)
Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) activation in the spinal cord (SC) may cause hyperalgesia as well as analgesia, possibly depending on the concentration of nicotinic agonist being used. RT-PCR experiments have already suggested the expression of a fairly great number of subunits and hence of types of receptors in the rat spinal cord. We confirm that mRNA coding for the subunits α2, α3, α4, α5, α6, β2 and β4 is present in the mouse SC. This multiplicity allows, in principle, a great number of different nAChRs. The localization of these receptors, determined by immunohistochemical staining and autoradiography of SC kryosections, showed high densities in dorsal regions of the grey matter, where pain-mediated pathways access the grey matter. In an attempt to assign the analgesic and hyperalgesic properties of nicotinic ligands to a particular type of receptor we have, in a first step, determined the subunit composition of nAChRs by [3H]-epibatidine binding, combined with single and/or sequential immunoprecipitation (IP). We used self-generated (rabbit) antibodies directed against the cytoplasmic loop. Our affinity-purified antibodies are extensively tested with recombinant receptors expressed in HEK293 cells, with materials taken from wild type (WT) mice, and - as a negative control - with materials from knock-out (KO) mice with deletions of distinct nAChR subunit genes.
IP with the combined use of anti-β2 plus anti-β4 antibodies revealed a relatively low total number of 43.7 ± 1.16 fmol/mg protein binding sites in the spinal cord of WT C57Bl/6J mice. About 85 % of these receptors contain the subunits α4 and β2, whereas α3 co-assembled with β4 to make up for about 10% of the receptors. Nonetheless, our data indicate that α3 also co-assembles into receptors that contain β2 (but not β4). The subunits α2 and α5 were measurable but occurred at low numbers only (2.5% and 2%, respectively), whereas α6-containing receptors could not be detected.
These observations were confirmed by using mice with targeted deletions of the β2 or the β4 subunit. In the β2 KO, overall receptor levels dropped to 10%, matching the amount of β4 – containing receptors in the wild-type. We did not detect any compensation for the dramatic loss of β2-containing receptors by any other subunit. Conversely, receptor frequency in β4 KO animals was similar to the wild-type.
The use of mouse KO models also permits an assessment of the kinetics of [3H]-epibatidine binding to defined (yet not recombinant) receptors in a membrane preparation.
Hence, the Kd of α3β4* receptors analyzed in the SC of animals lacking β2 (160 ± 24 pmol) was three times higher than in WT animals (53.7 ± 6 pmol), where most of the receptors are composed of α4 and β2.
Overall, our observations show a fairly heterogeneous entity of nAChRs in the SC for which to find ligands that specifically mediate anti-nociception will be a demanding task.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
pain acetylcholinereceptor (AChR) spinal cord subunits immunoprecipitation
Schlagwörter
(Deutsch)
Schmerz Azetylcholinrezeptor (AChR) Rückenmark Untereinheiten Immunpräzipitation
Autor*innen
Florian Grössl
Haupttitel (Englisch)
The hetero-pentameric nicotinic acetylcholinereceptor in the spinal cord of mice
Paralleltitel (Deutsch)
Der hetero-pentamere nikotinische Azetylcholinrezeptor im Rückenmark von Mäusen
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
76 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Petra Scholze
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.38 Pharmakologie
AC Nummer
AC09427527
Utheses ID
14234
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |