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Role of histone modifications in DNA repair in Candida albicans
Eva Stappler
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Karl Kuchler
DOI
10.25365/thesis.15928
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29478.10091.630069-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Candida albicans (Ca), der häufigste human-pathogene Pilz, besonders bei immungeschwächte Patienten, zeigt mehrere unterschiedliche Wachstumsmorphologien, wie Hefe, Pseudohyphen und echte Hyphen. Filamentierung gilt als wichtiges Virulenzmerkmal, da der Wechsel zwischen Hefe- und Hyphenform mit Virulenz assoziiert ist. Verschiedene Umwelt- oder Wirtsstimuli können filamentöses Wachstum induzieren. Wachstum als Pseudohyphen kann zum Beispiel durch Behandlung mit genotoxischen Substanzen oder Depletion von Komponenten, die in die Antwort auf DNA-Schäden involviert sind, ausgelöst werden. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind die Histonacetyltransferasen Hat1, die mit der Untereinheit Hat2 einen Komplex bildet, und Rtt109, die mit Asf1 interagiert, in die Reparatur von DNA-Schäden involviert. Daher haben wir die Rolle von Hat1/Hat2 und Rtt109 in Ca analysiert. Um die Funktion von CaHat1 und CaHat2 zu untersuchen wurden polyklonale Antikörper in Kaninchen produziert. Die
C-terminale Region von Hat1 bzw. Hat2 wurde als lösliches GST-Fusionsprotein expremiert, aufgereinigt und als Antigen verwendet.
Weiters, um die subzelluläre Lokalisierung von Hat2 zu untersuchen, wurde ein YFP-markiertes Hat2 Fusionsprotein konstruiert und in das Candida albicans Genom integriert. Durch Testen der Sensitivität auf DNA-schädigende Substanzen wurde die Funktionalität von Hat2-YFP verifiziert. In der Anwesenheit von Hat1 ist Hat2-YFP hauptsächlich im Kern lokalisiert, wohingegen die Kernlokalisierung in einem hat1Δ/Δ Hintergrund verloren geht. Behandlung mit der DNA-schädigenden Substanz Methylmethansulfonat führte zu einer Steigerung der Signalintensität im Kern.
Deletion von RTT109 führte zu Hyperfilamentierung, ähnlich zu dem, was schon in hat1Δ/Δ und hat2Δ/Δ Stämmen beobachtet wurde. rtt109Δ/Δ Zellen zeigten eine runzelige Koloniemorphologie und wuchsen als Pseudohyphen unter Bedingungen, die die Hefeform begünstigen. Außerdem waren sie hypersensitiv auf DNA-schädigende Substanzen.
Es war uns nicht möglich einen asf1Δ/Δ Stamm zu produzieren. Daher ist anzunehmen, dass ASF1 in Ca essentiell ist. Ein Allel von ASF1 konnte unter einen konditionellen Promotor gestellt werden, allerdings war es nicht möglich das zweite Allel zu deletieren.
Weiters wurden einige Histone H4 Mutanten konstruiert. Mutationen von Lysinen sollten die acetylierte oder unacetylierte Form von Hat1 Substraten nachahmen. Dazu wurden alle bis auf eine Kopie von Histon H4 deletiert und eine mutierte H4 Variante integriert. Eine Histon H4 Variante, die die acetylierte Form von H4 nachahmt, wurde auch in den hat1Δ/Δ Stamm integriert, um zu sehen, ob der hat1Δ/Δ Phänotyp wieder umgekehrt werden kann. Leider zeigten die Zellen, auch wenn die acetylierte Form von beiden Hat1 Acetylierungsstellen nachgeahmt wurde, weiter den hat1Δ/Δ Phänotyp von Hypersensitivität auf DNA-schädigende Substanzen und filamentöses Wachstum.
Abstract
(Englisch)
Candida albicans (Ca), an important human fungal pathogen, especially for immunocompromised patients, shows several distinct growth morphologies including yeast, pseudohyphal or true hyphae forms. Filamentation is considered a major virulence trait, since morphological transition from yeast to hyphae has been associated with Ca virulence. Various environmental or host stimuli can induce filamentous growth. For instance, treatment of Ca with genotoxic agents or depletion of components involved in the DNA damage response can trigger pseudohyphal growth. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the histone acetyltransferases Hat1, which forms a complex with the subunit Hat2, and Rtt109, which also interacts with Asf1, are implicated in DNA damage repair. We therefore analyzed the function of Hat1/Hat2 and Rtt109 in Ca. To investigate the function of CaHat1 and CaHat2, rabbit polyclonal antibodies were raised. The C-terminal region of Hat1 and Hat2, respectively, were expressed as soluble GST-fusion proteins, purified and used as antigens.
Moreover, to investigate the subcellular localization of Hat2, a YFP-tagged Hat2 fusion protein was constructed and integrated into the Ca genome. The functionality of Hat2-YFP was verified by testing the sensitivity to DNA-damaging agents. In the presence of Hat1, Hat2-YFP was mainly localized in the nucleus, whereas in a hat1Δ/Δ background the nuclear localization was lost. Treatment with DNA-damaging agent MMS led to an increase of the signal intensity in the nucleus.
Homozygous deletion of RTT109 resulted in a hyperfilamentation phenotype, similar to what has been observed for hat1Δ/Δ as well as hat2Δ/Δ strains. rtt109Δ/Δ cells showed wrinkled colony morphology and pseudohyphal growth under yeast-promoting conditions. Furthermore, they were hypersensitive to DNA damaging agents.
A homozygous asf1Δ/Δ strain could not be obtained, suggesting that ASF1 is essential in Ca. Placing ASF1 under a conditional promoter was successful for the first allele, but the second allele could not be deleted.
Furthermore, various histone H4 mutants were constructed to study the effect of lysine acetylation. Mutations of lysine residues should mimic the acetylated or unacetylated state of Hat1 target residues. For this purpose, all but one histone H4 copies were deleted and the mutated H4 variant was integrated. A histone H4 variant mimicking the acetylated state of H4 was also introduced into the hat1Δ/Δ strain to see, if the hat1Δ/Δ phenotype could be rescued. Even when the acetylated state of both Hat1 acetylation sites was mimicked, cells still showed the hat1Δ/Δ phenotype of hypersensitivity to DNA damaging agents and filamentous growth.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Candida albicans histone modifications
Schlagwörter
(Deutsch)
Candida albicans Histonmodifizierung
Autor*innen
Eva Stappler
Haupttitel (Englisch)
Role of histone modifications in DNA repair in Candida albicans
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von Histonmodifizierungen bei der DNA-Reparatur in Candida albicans
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
95 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Karl Kuchler
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC09590798
Utheses ID
14294
Studienkennzahl
UA | 490 | | |