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Illuminating the functional role of PTPA via knock down analyses and determination of its subcellular localization
Sarah Maria Schönbauer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Egon Ogris
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URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29782.40679.742055-0
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen repräsentieren wichtige Modifizie-rungen in intrazellulären Signalkaskaden, welche für die Aktivierung und Deaktivierung der jeweiligen Proteine verantwortlich sind. Eine der häufigsten Serin/Threonin Phosphatasen, PP2A, Protein Phosphatase 2A, erfüllt dabei eine wichtige Rolle in der Zellzyklusregulation, im programmierten Zelltod sowie in Signaltransduktionswegen. Heterotrimere Holoenzyme reprä-sentieren dabei das aktive und spezifische PP2A, welches wiederum sehr genau reguliert werden muss um die Interaktion mit verschiedenen Substraten bewerkstelligen zu können. Unterschied-liche Studien verdeutlichten bereits, dass sowohl Phosphorylierung als auch Methylierung wich-tige Modifikationen für die Funktion von PP2A darstellen. PTPA, der Phosphtase 2 A Phosphatase Aktivator, wurde ursprünglich als Aktivator der in vitro Phosphotyrosin Phosphatase Aktivität von PP2A identifiziert [Cayla et al, 1990]. Zusätzlich zeigten Fellner und Kolleg_innen, dass eine Deletion der homologen Proteine von PTPA in He-fe, RRD1 und RRD2, sowohl die katalytische Aktivität von PP2A reduziert als auch die Sub-stratspezifität, Proteinstabilität und Abhängigkeit von Metallionen beeinträchtigt. Kürzlich wur-de gezeigt, dass inaktives PP2A durch PTPA reaktiviert werden kann. Dennoch fehlt bisher die Charakterisierung der exakten Funktion von PTPA in Säugetieren. Der Umstand, dass Säugetier-PTPA den Wildtyp Phänotyp von einem rrd1∆/rrd2∆ Hefestamm komplementieren kann, bestärkt die Hypothese einer konservierten und essentiellen Funktion von PTPA. Frühere Studi-en zeigten zudem, dass sowohl durch Überexprimierung als auch durch Knock-down von PTPA, apoptotische Bedingungen entstehen und dieses Protein insofern eine essentielle Rolle einnimmt. Deshalb war es ein Teilziel dieser Arbeit mittels shRNA und siRNA weitere Konsequenzen eines PTPA-Knock-down in Säugetierzellen zu untersuchen. Einzelzellklone einer HelaTRex Zelllinie, stabil transfiziert mit einem Vektor, der eine induzierbare Expression einer shRNA gegen die mRNA von PTPA kodiert, zeigten eine effiziente Reduktion des Proteins auf 15% der normalen Menge. Zusätzlich wurden siRNAs (short interfering RNAs) angewandt und erzielten einen PTPA Knock-down auf 1/4 der normalen Menge. Schließlich wurden beide Methoden kombiniert, konnten aber keine weitere Reduzierung der Proteinmenge von PTPA erreichen. Trotz geringer Mengen von PTPA, konnte keine signifikante Veränderung des Phänotyps beo-bachtet werden. Darüber hinaus wollten wir mithilfe der Anwendung verschiedener PTPA spezifischer Antikör-per, in Experimenten der subzellulären Fraktionierung und Immunfluoreszenz, die subzelluläre Lokalisierung des Proteins aufdecken. Western-Blot-Analysen konnten in Hela-Zellen, welche in Kern- und Zytoplasmafraktionen unterteilt wurden, ein hauptsächliches Vorkommen von PTPA im Zytoplasma bestätigen. Im Gegensatz dazu trat PTPA in Analysen von Immunfluoreszenzen vorrangig im Kernkompartiment auf.
Abstract
(Englisch)
Protein phosphorylation and dephosphorylation, carried out by kinases and phosphatases respec-tively, represent hallmarks of intracellular signalling cascades. One of the most abundant ser-ine/threonine phosphatases PP2A, protein phosphatase 2A, fulfills distinct roles in cell cycle regulation, programmed cell death and signal transduction pathways. Active and specific PP2A is represented by heterotrimeric holoenzymes, which need to be tightly regulated to cope with various substrates. Different studies revealed posttranslational mechanisms, as for instance phosphorylation and methylation, to be key modifications for the regulation of PP2A. PTPA, the phosphtase two A phosphatase activator, was originally identified as an activator of the in vitro phosphotyrosyl phosphatase activity of PP2A [Cayla et al, 1990]. Furthermore, Fell-ner and coworkers showed a deletion of the yeast homologues of PTPA, RRD1 and RRD2, to reduce catalytic activity, affect substrate specificity, protein stability and metal dependence of PP2A [Fellner et al., 2003]. Recently, inactive PP2A was shown to be reactivated by PTPA. Nevertheless, the identification of an exact function of PTPA in mammals is still missing. A conservation of function is emphasized through the ability of mammalian PTPA to complement the proliferation phenotype of a rrd1∆/rrd2∆ yeast strain. Moreover, previous findings of apop-totic conditions, emerging upon knock down or due to overexpression of PTPA in mammalian cell lines, pinpointed towards an essential role of PTPA. Therefore, we wanted to further elucidate the consequence of PTPA knock down in mammalian cells by the use of shRNA and siRNA. Single clones of HelaTRex cells, stably transfected with a vector coding for the inducible expression of a targeting shRNA against the mRNA of PTPA, were shown to efficiently reduce the protein to 15% of its normal amount. Furthermore, short interfering RNAs were applied and resulted in a PTPA protein knock down to 1/4 in comparison to normal amount. A combination of both methods, however, failed to decrease PTPA to lower levels. Despite these low amounts of PTPA, a significant alteration of phenotype could not be observed. Furthermore, we intended to unravel the subcellular localization of PTPA by the use of different antibodies specific for mammalian PTPA, applied in subcellular fractionation experiments and immunofluorescence analyses. Upon the subdivision of Hela cells into nuclear and cytoplasmic fractions, a major distributrion of PTPA in the cytoplasm was confirmed by immuno blot analy-sis. As opposed to this, PTPA seemed to emerge mainly in nuclear compartments if analysed with immunofluorescence.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
PTPA
Autor*innen
Sarah Maria Schönbauer
Haupttitel (Englisch)
Illuminating the functional role of PTPA via knock down analyses and determination of its subcellular localization
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
122 S. : Ill.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Egon Ogris
Klassifikationen
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie ,
42 Biologie > 42.84 Mammalia
AC Nummer
AC09590158
Utheses ID
14388
Studienkennzahl
UA | 441 | | |
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