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Bioassay-guided development and in vitro characterization of lectin-drug conjugates for the targeted intravesical therapy of bladder cancer
Britta Eggenreich
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Michael Wirth
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30203.84246.490265-9
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Delivery-System entwickelt, das, basierend auf dem Konzept des aktiven Drug-Targetings, zur Verbesserung der adjuvanten Therapie des nicht-muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms oder anderer intravesikal zugänglicher Erkrankungen beitragen soll. Das entwickelte Prodrug-System besteht aus fluoreszenzmarkiertem BSA (Bovines Serum Albumin), das über Divinylsulfon kovalent mit WGA (Wheat Germ Agglutinin) verknüpft wurde, welches als Targeting-Protein fungieren soll. Das Hauptaugenmerkt zunächst auf einer Optimierung der Kopplungs- und Reinigungsprozedur, wobei das Endprodukt zellkulturgestützt evaluiert wurde. Dabei erwies sich die Verwendung eines 20- fachen molaren Überschusses an WGA bezogen auf BSA als am geeignetsten. Um ein reines Produkt zu garantieren, wurden für die weitere Charakterisierung nach der Aufreinigung nur die ersten 10-12 Fraktionen des erhaltenen Peaks gepoolt. Unter den gewählten Bedingungen wurde so ein Konjugatgemisch mit durchschnittlichem Modifikationsgrad von 3-5 Molekülen WGA pro Molekül fBSA erhalten. Diese Parameter konnten dabei auch mit Hilfe alternativer Analyseverfahren (GEMMA, Acrylamid-Gelelektrophorese) bestätigt werden. Anhand von Zellstudien wurde nachgewiesen, dass das Konjugat zur spezifischen Bindung an die Zelloberfläche befähigt ist und in weiterer Folge relativ rasch von den Zellen internalisiert wird. Das konnte auch durch Fluoreszenzemissionsmessung vor und nach Behandlung mit Monensin untermauert werden. Um die Vermutung, dass WGA und somit auch das Kopplungsprodukt mit höherer Präferenz an maligne Zellen bindet, zu überprüfen, wurden konzentrationsabhängige Bindungsstudien neben SV-HUC-1 (Zellen ohne maligen Hintergrund) zusätzlich auch an 5637 (Tumorgrad 2) und HT1376 (Tumorgrad 3) durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Konjugat im höheren Konzentrationsbereich tatsächlich eine verstärkte Tendenz zur Bindung an Zellen mit malignem Hintergrund aufweist Außerdem wurden Konjugate mit PNA (Peanut Agglutinin) als Lektin entwickelt und deren Bindungsspezifität überprüft. Die RFI-Werte der Zelloberflächenbindung von fBSA/PNA-Konjugaten sind verglichen mit jenen der fBSA/WGA-Konjugate insgesamt sehr gering, was eventuell auf eine mangelnde Kopplungseffizienz im Fall von PNA hindeuten könnte. Zusätzlich wude fHSA (fluoreszenzmarkiertes humanes Serum Albumin) an WGA (Wheat Germ Agglutinin) gekoppelt. Allerdeings erwieß sich HSA als weniger homogen wie BSA. Die Feinjustierung der Konjugataufreinigung erschien deshalb mit dem homogeneren fBSA einfacher, überdies bietet der Einsatz von kostengünstigerem fBSA einen ökonomischen Vorteil Die Ergebnisse der vorliegenden Diplomarbeit belegen, dass fBSA/WGA-Konjugate einen ersten Schritt in Richtung Verbesserung der adjuvanten Therapie des nicht-muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms beruhend auf dem Konzept des aktiven Drug-Targetings darstellen könnten. Hinsichtlich der Spezifität der Bindung und deren Aufnahme in maligne Zellen sind weitere Untersuchungen in Arbeit
Abstract
(Englisch)
The structural and compositional characteristics of the urothelial tissue account for a problematically low bioavailability in intravesical therapy, and call for the implementation of penetration-promoting delivery modalities to improve treatment impact. This study presents the first biorecognitive approach for intravesical drug delivery, based on the specific interaction between lectins and the corresponding carbohydrates at the cell membrane. Fluorescence-labeled bovine serum albumin (fBSA) or human serum albumin (fHSA) was covalently coupled to wheat germ agglutinin (WGA) to yield a model prodrug (fBSA/WGA conjugate) for the characterization of cytoadhesive and cytoinvasive potential in cell culture models. Coupling protocol and purification procedure were optimized and validated by a comparative screening in bioassays and physicochemical analysis of molecular weight. Preliminary studies demonstrated the general applicability of the coupling procedure to lectins of different carbohydrate specificity. Binding and uptake by human urothelial cells of non-malignant origin (SV-HUC-1) were compared to that by cells deriving from grade 2 (5637) or grade 3 (HT-1376) urothelial carcinoma. In contrast to unmodified fBSA, WGA-conjugates were effectively internalized (>50%) and processed to acidic compartments. Specificity of the conjugate-cell interaction was validated via competitive inhibition with the complementary carbohydrate. Intracellular accumulation was followed microscopically and verified by monensin-induced de-quenching. Utilizing receptor-mediated endocytotic pathways, glycotargeted delivery platforms may thus provide a potent tool for the establishing of novel therapy concepts for intravesical application.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Drug Delivery Conjugate Lectin Wheat Germ Agglutinin Bovine Serum Albumine Urothelium Intravesical Therapy
Schlagwörter
(Deutsch)
Lektin Konjugate Wheat Germ Agglutinin Bovine Serum Albumin Urothel Intravesicale Therapie
Autor*innen
Britta Eggenreich
Haupttitel (Deutsch)
Bioassay-guided development and in vitro characterization of lectin-drug conjugates for the targeted intravesical therapy of bladder cancer
Paralleltitel (Deutsch)
Bioassay gestützte Entwicklung und in vitro Charakterisierung von Lektin-Arzneistoff-Konjugaten für die zielgerichtete intravesikale Therapie des Harnblasenkarzinoms
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
76 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Michael Wirth
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC08805991
Utheses ID
14726
Studienkennzahl
UA | 449 | | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1