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Deletion of the tail fibre protein of φCh1 and further characterization of the inversion within its gene locus

Petra Till

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Angela Witte

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DOI

10.25365/thesis.16520

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29157.04020.217259-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Ein Merkmal des haloalkaliphilen Virus φCh1 ist das Vorhandensein einer genomischen Region welche während des lysogene Zyklus des temperenten Phagens durch die viral codierte Rekombinase Int1 invertiert wird. Da dieses Ereignis einen Austausch der 3‘ Enden von ORF34 und ORF36 zur Folge hat, ermöglicht es die Bildung verschiedener Genprodukte von ORF34: die uninvertierte Variante (gp341) und jene Variante die den C-terminus von gp36 trägt (gp3452). Beide stellen mögliche „Tail-fibre“ Proteine von φCh1 dar, Strukturelemente die häufig an der Interaktion mit der Wirtszelle zu Beginn einer Infektion beteiligt sind. Aufgrund früherer Studien jedoch wurde eine Bedeutung für die Infektion von Natrialba magadii, dem einzigen Wirten von φCh1, nur bei gp3452 vermutet. Um die Funktion von gp3452 zu bestätigen, war es Ziel dieser Diplomarbeit durch Ersetzen der fraglichen Region durch eine Novobiocinresistenz (NovR) eine ORF34 Deletionsmutante herzustellen. Das Fehlen von gp34 in der lysogenen Kultur Nab. magadii L11-ΔORF34 wurde mittels Western Blot nachgewiesen. Außerdem konnten bestimmte phänotypische Merkmale der entsprechenden Phagenpartikel aufgezeigt werden. Einerseits konnten durch das Fehlen der „Tail-fibre“ Struktur erklärbare morphologische Veränderungen unter dem Elektronenmikroskop beobachtet werden. Andererseits wurde gezeigt, dass φCh1-ΔORF34 in seiner Fähigkeit Nab. magadii L13 zu infizieren zumindest stark eingeschränkt ist. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte sowohl die Funktion von gp3452, als auch seine Bedeutung für die Infektion von Nab. magadii nachgewiesen werden. Zusätzlich zu der Deletion des vermutlichen „Tail-fibre“ Proteins gp34, beschreibt diese Arbeit den Versuch durch Konkurrenz zwischen φCh1 und verschiedenen Mengen von gp3452 und gp3652 eine Reduktion des Phagentiters zu bewirken. Tatsächlich konnte ein tendenzieller Einfluss von gp3452 auf die Plaquezahl und Größe beobachtet werden, für eine eindeutige Schlussfolgerung jedoch wäre ein größerer Ansatz erforderlich. Der andere Teil dieser Diplomarbeit dient der Charakterisierung der Inversion. Zum Einen wurden durch Analyse mehrerer Klone, die sich entweder in der Orientierung oder in der Sequenz einzelner Repeats unterscheiden, möglicherweise entscheidende Eigenschaften der Zielregion von Int1 untersucht. Zum Anderen wurde die Bedeutung der Rekombinase Int1 durch Deletion des Startcodons geprüft. Außerdem wurde der Effekt eines möglichen Aktivators der Expression von int1 untersucht. In allen drei Fällen wurden Zeitreihen durchgeführt um das Auftreten möglicher Inversionsereignisse in Abhängigkeit von der Zeit unter den jeweiligen Bedingungen zu beleuchten. Schlussendlich konnte jedoch keines dieser Projekte weitere Einblicke in den Mechanismus der Inversion zwischen ORF34 und ORF36 liefern.

Abstract

(Englisch)

One special characteristic of the haloalcaliphilic virus φCh1 is the presence of a genomic region which gets inverted by the virus encoded site-specific recombinase Int1 during the lysogenic life cycle of the temperate phage. Since this inversion event results in an exchange of the 3’ ends of ORF34 and ORF36, this event gives rise to the formation of different gene products of ORF34: the non-inverted variant (gp341) and the variant comprising the C-terminus of gp36 (gp3452). Both of them represent putative tail fibre proteins of φCh1, structural elements which are often involved in interaction with the host cell during initiation of infection. Yet, based on previous studies only gp3452 was supposed to be crucial for infection of Natrialba magadii, the only known host of φCh1. To confirm the putative function of gp3452, this work aimed to produce an ORF34 deletion mutant by replacing of the concerned gene region with a novobiocin resistance cassette (NovR). The absence of gp34 in the resulting lysogenic culture Nab. magadii L11-ΔORF34 was demonstrated by western blot analysis. In addition certain phenotypic characteristics of the corresponding mutant phage particles could be pointed out. On one hand morphological changes which can be explained by the absence of tail fibre structure could be visualized by electron microscopy. On the other hand φCh1-ΔORF34 was shown to be at least strongly reduced in its ability to infect Nab. magadii L13. Based on these results, this work could present evidence for both, the function of gp3452 as the tail fibre protein of φCh1 as well as its crucial role in infection of Nab. magadii. In addition to deletion of the putative tail fibre protein gp34, this work describes an attempt to cause a reduction in the phage titre by competition of φCh1 with different amounts of purified gp3452 and gp3652. Indeed a tendency to an effect of gp3452 on the number and size of the plaques resulting from phage infection could be demonstrated, yet to enable a definite conclusion, a larger approach of titre analysis would be required. The other part of this thesis contributes to characterization of the inversion process. On one hand certain features of the Int1 target region were worked out by analysis of different clones varying either in the orientation or in the nucleic acid composition of the repeats recognized by Int1. On the other hand the role of the site-specific recombinase Int1 was investigated by deletion of its start codon, yielding a clone failing expression of this protein. Moreover the effect of a possible activator of int1 expression was examined. In all three cases time course experiments were performed in order to analyze the occurrence of inversion events depending on the growth phase under the respective conditions. However, none of these projects could yield further details about the mechanism of inversion within ORF34 and ORF36.

Autor*innen

Petra Till

Haupttitel (Englisch)

Deletion of the tail fibre protein of φCh1 and further characterization of the inversion within its gene locus

Paralleltitel (Deutsch)

Deletion des "Tail-fibre" Proteins von φCh1 und weitere Charakterisierung der Inversion innerhalb seines Genlocus

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

139 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Angela Witte

Klassifikationen

42 Biologie > 42.00 Biologie: Allgemeines ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC09584419

Utheses ID

14809

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter