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Development of a Triplex Assay for the simultaneous detection of Trichothecene and Fumonisin producing Fusarium strains by real-time PCR
Daniela Götsch
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Udo Bläsi
DOI
10.25365/thesis.16560
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29648.52473.930564-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Bei der Gattung Fusarium handelt es sich um pflanzenpathogene Pilze, deren Mykotoxine in Verdacht stehen Krankheiten vor allem bei Nutztier aber auch bei Menschen zu verursachen. Der Pilz selbst ruft unter anderem bei Weizen und Mais Krankheiten wie die Ährenfusariose bzw. Kolbenfäule hervor. Durch Fusarium Stämme kommt es zu beachtlichen Ernteausfällen weltweit was zu einem großen ökonomischen Schaden führt. Aufgrund dessen ist es wichtig immer neuere und verbesserte Methoden zur Eindämmung des Befalls aber auch zur Detektion der Mykotoxine bzw. der Pilz-Biomasse zu entwickeln. Mit Hilfe von chromatographischen Messverfahren wie LC-MS/MS lassen sich die Mykotoxingehalte sehr gut bestimmen. Möchte man den biologischen Aspekt miteinbeziehen und die Biomasse des pathogenen Pilzes bestimmen eignet sich dafür besonders die real-time PCR. In dieser Arbeit wurde mit dem Nachweis des Genes fum1 begonnen. Dieses Gen ist essentiell für die Biosynthese der Fumonisine. Verschiedene Primer-Paare wurden hierfür getestet. Als das am besten geeignete stellten sich die Primer von Waalwijk et. al. [88] heraus. Sie lieferten sehr gute Effizienzen (0.85-0.92) für alle fünf getesteten Fusarium Stämme. Des Weiteren wurde die DNA von Standards zur Quantifizierung gereinigt um konstantere Resultate zu erzielen. Eine früher entwickelte duplex Methode zum Nachweis von Trichothecen bildenden Pilzen wurde anhand eines großen Probensatzes evaluiert. Als Referenzgen für Mais dient das Gen für eine Alkohol-Dehydrogenase (adh1). Als Referenzgen für Trichothecen produzierende Fusarium Stämme wird tri5 verwendet, welches für ein Enzym codiert, das den ersten Schritt im Biosyntheseweg der Trichothecene katalysiert. Indem zur duplex Methode ein weiteres Gen, fum1, hinzugefügt worden ist, kam es über die gemeinsame Detektion von adh1 und fum1 bzw. fum1 und tri5, zur Entwicklung der triplex Methode. Die triplex Methode wurde durch einen Probensatz von 20 künstlich infizierten Maisproben evaluiert. Die erhaltenen Biomassewerte wurden mit Mykotoxinwerten aus der LC-MS/MS Analyse verglichen. Die Korrelation war bei tri5 mit einem R2 von 0.72 besser als bei fum1 mit einem R2 von 0.62. In dieser Arbeit wurde eine real-time PCR Methode entwickelt um gleichzeitig drei unterschiedliche Gene zu detektieren. Durch die gemeinsame Detektion aller zwei Gene für die Mycotoxinbildung und eines Referenzgenes für Mais kommt es nicht nur zu einer Zeitersparnis sondern auch zu einer beachtlichen Kostenersparnis.
Abstract
(Englisch)
Plant pathogenic fungi like Fusarium ssp. cause high economic impacts worldwide. These fungi are found on grains like wheat, maize and barely where they cause severe diseases like Fusarium head blight (FHB) or Fusarium ear rot. No total resistance could be achieved hence, as the genes providing resistances to Fusarium are located in distinct genomic regions. Based on the economic impacts it is important to investigate on revised methods for the detection of produced mycotoxins and the fungal biomass respectively. An appropriate method for the detection of mycotoxins is LC-MS/MS whereas the fungal biomass can be detected by real-time PCR. Initially, a singleplex assay for the detection of fumonisin producing Fusarium strains was developed. Various primer pairs were tested on five Fusarium strains for the detection of the fum1 gene encoding for a polyketide synthase. The most efficient primer pair has been found to be the primer pair published by Waalwijk et. al. [88]. These primers provided remarkable efficiencies (0.85-0.92) for all tested strains. Then, two distinct duplex methods were developed for fumonisin producing strains in a maize background (fum1/adh1 duplex) and both, fumonisin producing and trichothecene producing Fusarium strains respectively (fum1/tri5 duplex). The gene for alcohol dehydrogenase adh1 was used as reference gene for the detection of maize DNA while tri5 was used for the detection of trichothecene producing Fusarium strains. The triplex assay was achieved by application of all three primer pairs for the detection of fum1, tri5 and adh1. The triplex assay was evaluated by a set of 20 artificially infected maize samples. The obtained amounts of fungal biomass were compared to mycotoxin contamination obtained by LC-MS/MS method. Due to the simultaneous detection of all three genes in a single run a considerable time- and cost reduction for the analysis of maize samples could be achieved.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Fusarium real-time PCR Fumonisins Trichothecenes Maize Triplex assay
Schlagwörter
(Deutsch)
Fusarium real-time PCR Fumonisine Trichothecene Mais Triplex
Autor*innen
Daniela Götsch
Haupttitel (Englisch)
Development of a Triplex Assay for the simultaneous detection of Trichothecene and Fumonisin producing Fusarium strains by real-time PCR
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung einer Triplex Methode zur zeitgleichen Bestimmung von Trichothecen und Fumonisin bildenden Fusarium Stämmen mittels real-time PCR
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
68 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Udo Bläsi
AC Nummer
AC09427473
Utheses ID
14844
Studienkennzahl
UA | 441 | | |