Detailansicht
Bestimmung des Grades der Genpromotormethylierung mittels methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse
Elisabeth Habla
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.16854
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30496.25068.406062-5
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die DNA-Methylierung von Cytosin in den Promotorsequenzen von Genen spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der Gen-Expression. Veränderungen des Methylierungsgrades der DNA stehen im Verdacht, verschiedenste Erkrankungen, darunter auch Krebs, auszulösen. Durch den frühen Zeitpunkt des Auftretens der Methylierung im Krankheitsverlauf, bietet sich der Methylierungsstatus als Biomarker zur Früherkennung von Krebserkrankungen an.
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden Analysenmethoden, basierend auf der methylierungs-sensitiven hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) entwickelt, um den Methylierungsgrad in der Promotorregion von Genen bestimmen zu können. Bereits publizierte Regeln wurden angewendet, um methylierungs-unabhängige Primer (MIP) zu entwerfen und die MS-HRM Bedingungen zu optimieren. Die Entwicklung von Primern erfolgte für die Gene APC (Adenomatous Polyposis Coli), HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1) , DAPK1 ( Death Associated Protein Kinase 1) und OSMR (Oncostatin M Rezeptor), welche mit der Entstehung von kolorektalen Karzinomen in Verbindung gebracht werden. Zur Entwicklung und Optimierung der MS-HRM Methoden wurden Mischungen von kommerziell erhältlicher methylierter und unmethylierter DNA herangezogen. Durch Optimierung der MS-HRM Bedingungen, insbesondere der Annealing-Temperatur und der MgCl2-Konzentration, konnte die Selektivität der Amplifikation für methylierte und unmethylierte Template ausgeglichen werden.
Die MS-HRM Methoden wurden angewendet, um den Methylierungsstatus in der Promotorregion in HT-29 kolorektalen Karzinomzellen zu bestimmen. Die Promotorregionen des APC und DAPK1 Gens zeigten in HT-29 Zellen keine Methylierung. Die Promotorregion des HIC1 war zu 100%, die des OSMR Gens zu 95% methyliert.
Um zu prüfen, ob Lebensmittelinhaltsstoffe und –kontaminanten einen Einfluss auf den Methylierungsgrad haben, wurden HT-29 Zellen mit den Mykotoxinen Deoxynivalenol und Zearalenon, den heterozyklischen aromatischen Aminen PhIP und MeIQx und den Lignanen (+)-Lariciresinol und (-)-Matairesinol inkubiert. Kontrollexperimente wurden mit der demethylierenden Substanz 5-Aza-2dC und reinen Lösungsmitteln durchgeführt. Erste Ergebnisse zeigen, dass mit Ausnahme von 5-Aza-2dC keine der getesteten Substanzen den Methylierungsstatus in der Promotorregion der Gene APC, HIC1, DAPK1 und OSMR in HT-29 Zellen ändert.
Abstract
(Englisch)
DNA methylation of cytosines in promoter regions of genes plays a key role in regulating gene expression. Changes of DNA methylation patterns have been associated with the occurrence of different diseases, among them cancer. Because of the early incidence of methylation in carcinogenesis, aberrant DNA methylation patterns may be used as biomarkers for early cancer detection.
In the present diploma thesis, analytical methods based on methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM) analysis were developed for the determination of the methylation status in the promoter region of genes. Previously published guidelines were used for the design of methylation -independent primers and the optimization of MS-HRM settings. Primer design was realized for the genes APC (Adenomatous Polyposis Coli), HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1) , DAPK1 ( Death Associated Protein Kinase 1) and OSMR (Oncostatin M Rezeptor) which are all associated to colorectal carcinoma. Development and optimization of the MS-HRM methods were carried out with mixtures of commercially available methylated and unmethylated DNA. By optimization of the MS-HRM settings, in particular the annealing temperature and the MgCl2 concentration, the selectivity for amplification of methylated and unmethylated DNA sequences could be balanced.
The MS-HRM methods were applied to determine the methylation status of the promoter regions in HT-29 colorectal carcinoma cells. The promoter regions of the APC and DAPK1 gene in HT-29 cells did not show any degree of methylation. The promoter regions of the HIC1 and OSMR gene were found to be 100% and 95%, respectively.
In order to investigate if food ingredients and food contaminants show any influence on the methylation status, HT-29 cells were incubated with the mycotoxins deoxynivalenol and zearalenone, the heterocyclic aromatic amines PhIP and MeIQx and the lignans (+)-lariciresinol, (-)-matairesinol. Control experiments were carried out with the demethylating agent 5-Aza-2dC and pure solvents. First results showed that with the exception of 5-Aza-2dC none of the substances changed the methylation status of the promoter region of the genes APC, HIC1, DAPK1 and OSMR in HT-29 cells.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
DNA methylation polymerase chain reaction PCR high resolution melting, HRM MS-HRM colorectal cancer primer design methylation sensitive
Schlagwörter
(Deutsch)
DNA-Methylierung Polymerase-Kettenraktion PCR hochauflösende Schmelzkurvenanalyse Kolonkrebs Primersuche methylierungs-sensitiv
Autor*innen
Elisabeth Habla
Haupttitel (Deutsch)
Bestimmung des Grades der Genpromotormethylierung mittels methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse
Paralleltitel (Englisch)
Methylation-sensitive high resolution melting for the analysis of gene promotor methylation patterns
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
IV, 131, A-I S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikation
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines
AC Nummer
AC08922465
Utheses ID
15108
Studienkennzahl
UA | 419 | | |