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Effects of BSA on in vitro Glucuronidation studies using human microsomes and recombinant enzymes
Paolo Svaluto Moreolo
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Brigitte Kopp
DOI
10.25365/thesis.16924
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29918.01797.612662-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
UDP-glucuronosyltransferasen (UGTs) bilden eine Familie von u. A. humanen Metabolisierungsenzymen. UGTs transferieren Glucuronsäure vom Cosubstrat (UDP-Glucuronsäure) auf ein Substrat. Dadurch wird das Substrat hydrophiler und somit besser ausscheidbar.
Um die Verfügbarkeit von Arzneistoffen im Körper zu ermitteln und um Nebenwirkungen zu verhindern, werden in vitro Tests entwickelt, die es ermöglichen die katalytische Aktivität der UGTs vorherzusagen. Ältere Publikationen zeigten, dass das Zugeben von Rinderserumalbumin (BSA)
bei in vitro Tests, die Aktivität dieser Enzyme steigerte. Diese Wirkung entsteht wahrscheinlich durch das Entfernen von kompetitiv inhibierenden Fettsäuren. Durch klinische Studien wurde nachgewiesen, dass auf diese Weise erworbene
Daten besser mit in vivo Daten übereinstimmen.
Mit dieser Arbeit wollten wir die Wirkung von BSA auf die
Glucuronidierung von 4-Methylumbelliferon (4MU) und Entacapon durch eine Gruppe von unerforschten UGT Isoformen (UGTs 1A7, 1A8, 1A10, 2A1 und 2A15) analysieren. Die Glucuronidierung von 4MU durch UGT1A9 wurde durchgeführt, um unser System mit schon publizierten Daten zu vergleichen. Zum selben Zweck wurden auch kommerziell verfügbare humane Lebermikrosomen (HLM) und Darmmikrosomen (HIM) getestet.
Mit Ausnahme der Kinetiken von 4MU durch HIM, konnten wir zeigen, dass alle getesteten Enzyme von einem nichtkompetitiven Inhibitor (genauer „mixed type Inhibitor“) beeinflusst wurden. Dadurch dass die Entfernung des Inhibitors (vermutlich eine Mischung an Fettsäuren) eine weitere Bindetasche für das Substrat freistellte, folgerten wir, dass das Substrat und die Fettsäuren um die selbe inhibierende Bindetasche konkurrieren. Angesichts der Tatsache, dass Fettsäuren auch an die katalytische Tasche binden können, vermuteten wir, dass diese, dem Anschein nach ähnliche Taschen, die homologen Taschen eines Enyzmdimers darstellen. Das Auftreten von Dimeren in UGTs wurde schon in früheren Publikationen postuliert, aber noch nicht vollkommen bestätigt.
Abstract
(Englisch)
UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are a family of metabolizing enzymes present in the human body. The UGTs transfer a moiety of glucuronic acid from the cosubstrate UDP-glucuronic acid (UDP-GA) to the substrate in order to make it more hydrophilic and therefore better excretable from the body.
In vitro tests for the prediction of the catalytic activity of UGTs are being developed to analyze the availability of drugs in the body and to reduce eventual side effects. It has been found, that the addition of BSA to the incubation mixture increases the activity of these enzymes in vitro, probably by removing competitively inhibiting fatty acids (FAs). Data retrieved by this method have shown to be more consistent to the data evaluated in vivo.
Our objectives were to test the effect of BSA on the glucuronidation of 4-methylumbelliferone (4MU) and entacapone by an untested group of UGTs which includes the UGTs 1A7, 1A8, 1A10, 2A1 and 2B15. The glucuronidation of 4MU by UGT1A9 was performed to compare our system with the previously published data. Also the commercially available HLM and HIM have been tested for the purposes of comparison.
With the exception of the kinetics of 4MU by HIM, all our tested enzymes were shown here to be inhibited by a mixed type inhibitor. Contrary to earlier findings from another laboratory, the inhibitor in our system was not only binding to the same binding site as the aglycone substrate. Given by the observation that the inhibitor(s) removal increased or even unmasked the presence of a second substrate binding site, we concluded that the inhibitor (possibly fatty acids) and the substrate have affinity to both a catalytic and an inhibititory binding site. This suggestion is in agreement with the possibility that UGTs can form homo- and hetero-dimers, and that interactions occur between the two monomers within the dimeric UGT.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
BSA UGT Entacapone 4-Methylumbelliferon
Schlagwörter
(Deutsch)
Rinderserumalbumin UGT Entacapon 4-Methylumbelliferon
Autor*innen
Paolo Svaluto Moreolo
Haupttitel (Englisch)
Effects of BSA on in vitro Glucuronidation studies using human microsomes and recombinant enzymes
Paralleltitel (Deutsch)
Der Einfluss von Rinderserumalbumin auf in vitro Glucuronidierungsstudien unter Verwendung von humanen Mikrosomen und rekombinant hergestellten Enzymen
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
VIII, 75 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Brigitte Kopp
AC Nummer
AC08838016
Utheses ID
15169
Studienkennzahl
UA | 449 | | |