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Characterization of heterochromatin formation in an Xist RNA inducible transgenic mouse line

Susanne Arthold

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Georg Weitzer

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DOI

10.25365/thesis.17121

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29513.09603.450869-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die nicht-kodierende Xist RNA ist entscheidend für die Initiation der chromosomweiten Genrepression während der X-Inaktivierung in weiblichen Säugetierzellen. Die Stilllegung X-spezifischer Gene ist abhängig von einer sich wiederholenden Sequenz am 5´Ende von Xist. Untersuchungen an murinen embryonalen Stammzellen zeigten, dass dieses sogenannte „repeat A“-Element essenziell für die Initiation der Genrepression durch Xist ist. Es wurde gezeigt, dass die Expression einer Xist RNA mit fehlendem repeat A zwar alle charakteristischen Chromatinmodifikationen herbeiführen kann, Gene an diesem Chromosom jedoch aktiv bleiben. In diesem Projekt wird untersucht, ob eine solche Chromosomen-Konfiguration mit der embryonalen Entwicklung vereinbar ist. Dafür wurde ein transgenes Mausmodell etabliert, bei dem die Expression einer Xist RNA mit fehlendem repeat A am 3´Ende des Col1a1 Locus am Chromosom 11 mittels Doxyzyklin induzierbar ist. Es wird gezeigt, dass die Expression der mutierten Xist RNA zu Histon H3 - Lysin 27- trimethylierung (H3K27m3) führt, jedoch keine erkennbare Histon H4 - Deacetylierung beobachtet werden kann. Die Expression der transgenen Xist RNA ohne repeat A in vivo in der frühen embryonalen Entwicklung zeigt einen starken, unerwarteten Phänotyp, der zu embryonaler Letalität vor Tag 9.5 der Embryonalentwicklung führt (E9.5). Interessanterweise wurde dieser Phänotyp ebenso bei heterozygoter Expression des Transgens beobachtet und ist unabhängig von der parentalen Herkunft der Xist RNA. Expression in einem späteren Stadium der Entwicklung (E11.5) zeigt keinen offensichtlichen Phänotyp was darauf hinweisen könnte, dass Genexpressionsmuster in der frühen embryonalen Entwicklung durch epigenetische Modifikationen gestört werden. Um den molekularen Mechanismus des beobachteten Phänotyps zu untersuchen, wurden embryonale Stammzelllinien aus Blastocysten etabliert, welche homozygot induzierbare Xist RNA ohne repeat A am Chromosom 11 tragen. Mit Hilfe dieses in vitro Systems wurde eine genomweite Genexpressionsanalyse mittels Affymetrix Maus Array durchgeführt. Drei unabhängig voneinander isolierte embryonale Stammzelllinien wurden mit Retinolsäure für 5 Tage entweder mit oder ohne Doxyzyklin differenziert und die Unterschiede in der Genexpression zwischen induzierten und nicht induzierten Zelllinien verglichen. Die Ergebnisse zeigen nur minimale Unterschiede in der Genexpression. Ein höherer Prozentsatz an herunterregulierten Genen konnte am Chromosom 11 beobachtet werden was darauf hinweist, dass Expression der transgenen Xist RNA ohne repeat A eine verbleibende Funktion in der Gen-Stilllegung im autosomalen Kontext aufweist. Die am stärksten herunterregulierten Gene sind keine Zielgene für Polycomb-Komplexe und scheinen in der Differenzierung herunterreguliert zu werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Expression einer transgenen Xist RNA ohne repeat A vom Chromosom 11 zwar H3K27m3 etabliert, jedoch keine signifikante H4 Deacetylierung beobachtet werden kann. Dreiviertel der Gene, die am Chromosom 11 lokalisiert sind, werden in geringem Ausmaß herunterreguliert, was offensichtlich mit der embryonalen Entwicklung der Maus nicht vereinbar ist. Es ist anzunehmen, dass die betroffenen Gene notwendig sind für spezifische Differenzierungswege in der frühen embryonalen Entwicklung und bereits geringe Änderungen in der Expression zu embryonaler Letalität führen

Abstract

(Englisch)

The non-coding Xist RNA is the trigger of chromosome-wide gene repression during X inactivation in mammals. Gene repression depends on a repeated sequence on the 5´ of Xist. Studies in mouse embryonic stem cells (ESCs) have shown that this repeat A element is essential for the initiation of gene silencing by Xist. Expression of Xist lacking repeat A has been shown to lead to an X chromosome which possesses all chromatin modifications of the inactive X chromosome (Xi) but genes remain active. Here, we investigate if such a chromosome configuration can be compatible with development. For this we have established mice harbouring transgene for inducible expression of repeat A deleted Xist RNA from the Col1a1 locus on chromosome 11. We show that induction of Xist lacking repeat A in embryonic cells leads to histone H3 lysine 27 tri-methylation (H3K27m3) but no noticeable decrease in histone H4 acetylation. Our experiments reveal an unexpected strong phenotype leading to embryonic lethality most likely before embryonic day 9.5. Notably, the phenotype was observed also in mice heterozygous for the transgenic chromosome 11 and independent of the parental origin of the transgene. However, no obvious phenotype could be observed after late induction of Xist. This suggests that in early development gene expression patterns might be disrupted by epigenetic modifications triggered by Xist without repeat A. To investigate the molecular basis of this phenotype we have established ESCs from homozygous transgene bearing blastocysts and performed genome-wide gene expression profiling using Affymetrix mouse array analysis of three independently derived ES cell lines either with induction of Xist or without. We compared expression differences between induced and non-induced cells after 5 days of differentiation with retinoic acid. Our results show only little misregulation of genes with low fold changes. However, we could investigate a higher percentage of downregulated genes on chromosome 11 which suggests remaining silencing function of transgenic Xist RNA lacking repeat A in an autosomal context. Most significantly downregulated genes are no Polycomb target genes and seem to be downregulated upon differentiation. The assumption that developmental genes are prevented to be upregulated upon differentiation by transgenic Xist RNA expression could not be confirmed. Overall, our results show that expression of Xist RNA lacking repeat A from chromosome 11 establishes H3K27m3, but no significant H4 hypoacetylation. Genes on this modified chromosome are slightly downregulated which is obviously not compatible with mouse embryonic development. We suggest that misregulated genes on chromosome 11 are necessary for a lineage specific differentiation pathway early in development and already little downregulation causes embryonic lethality

Autor*innen

Susanne Arthold

Haupttitel (Englisch)

Characterization of heterochromatin formation in an Xist RNA inducible transgenic mouse line

Paralleltitel (Deutsch)

Charakteristik der Heterochromatisierung in einer Xist RNA induzierbaren, transgenen Mauslinie

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

84 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Anton Wutz

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.23 Entwicklungsbiologie

AC Nummer

AC09396904

Utheses ID

15344

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter