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Biochemical and structural characterization of preformed EGF receptor dimers
Jesus Fernandez Rodriguez
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Thomas Marlovits
DOI
10.25365/thesis.17131
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29288.09211.992864-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) sind eine Gruppe von Proteinen, die in die Plasmamem- bran eingebettet und für die Zell-Signalisierung verantwortlich sind. Im Menschen umfassen RTK 59 Gene,die in 20 Familien eingeteilt werden. Dazu gehört die Familie der Epidermalen-Wachstumsfaktor-Rezeptoren (ErbB oder HER), die wiederum aus vier Mitgliedern besteht: EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2/Neu, ErbB3/HER3 und ErbB4/HER4. Diese binden unterschiedliche Liganden und bilden eine Reihe von Homo- und Heterodimeren um verschiedene zelluläre Antworten hervorzurufen. ErbB-Rezeptoren sind verantwortlich dafür, Signalisierung durch Liganden-induzierte Dimerisierung auszulösen und sind in Signalnetzwerke involviert, die mit Zellwachstum und Zelldifferenzierung in Verbindung gebracht werden. Viele Mutationen der ErbB- Rezeptoren führen zu Zelltransformation und Krebs.
Obwohl vieles über die Struktur und Aktivierung der ErbB-Rezeptoren bekannt ist, fehlt ein komplettes Bild der molekularen Mechanismen, die zu einer Umwandlung extrazellulärer in intrazelluläre Signale führen (der Aktivierung der Kinase-Domänen). Ein Teil der ErbB-Rezeptoren in der Plasmamembran können bei Abwesenheit von Liganden die Form von vorgeformten, nicht-kovalent verbundenen Dimeren annehmen.
Im Fall von EGFR bindet der Rezeptor in vivo Liganden mit zwei Affinitäten. Bei einer Aufreinigung des Rezeptors bleibt allerdings nur die Komponente mit niedriger Affinität übrig. Es wird vermutet, dass die hohe Affinitätsbindung und die vorgeformten Dimere in einem Zusammenhang stehen und eine Art negative Kooperativität aufweisen.
Aus diesem Grund entwickelte ich eine Methode, die es erlaubt, die strukturelle sowie biochemische Charakterisierung der vorgeformten EGFR-Homodimere durchzuführen. Die Schwierigkeit lag darin, ein Werkzeug einzuführen, das die Reinigung der vorgeformten Dimere ermöglicht, ohne auf die Zusetzung kovalenter Modifikationen zurückgreifen zu müssen, welche die inhärente Flexibilität und Struktur der Rezeptoren verhindern.
In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die es erlaubt, die EGF-Rezeptoren bei Abwesenheit der Liganden in einem dimerisierten Zustand während des Reinigungsprozesses zu erhalten. Dieses Werkzeug besteht aus einem de novo konstruierten heterodimerischen ”coiled-coil” (Doppelwenden), das E3/K3 genannt wird. Dieses Paar wurde bereits beschrieben, jedoch noch nicht zu einem Protein fusioniert. Aus diesem Grund testete ich das Verhalten des E3/K3 Paares mit Hilfe der fluoreszierenden Proteinen Venus und ECFP. Durch die Verwendung von Affinitätsreinigungs- und Gelfiltrationstechniken sowie von FRET zeige ich, dass das E3/K3 Paar sehr gut für die Heterodimerisierung zweier Proteine geeignet ist. Es ist außerordentlich spezifisch und die Interaktion hält dem Reinigungsprozess stand.
Anschließend wurde das E3/K3 Dimerisierungsmodul in EGF-Rezeptoren transplantiert und in CHO-Zellen exprimiert. Die Ergebnisse zeigen, dass EGFR auch bei Abwesenheit des Liganden in dimerischer Form gereinigt werden und weiterhin in vitro Liganden binden kann, ohne Tyrosinkinase-Aktivität zu verlieren. Außerdem ist die Probe extrem rein und es kann für strukturelle Studien mit Single-Particle-Negative- Staining benutzt werden. Ich stelle eine dreidimensionale Rekonstruktion eines vorgeformten EGFR Homodimers vor wobei (soweit bekannt) zum ersten Mal eine in der
vollen Länge RTK gezeigt werden kann. Überraschenderweise zeigt der vorgeformte EGFR Dimer Ektodomänenasymmetrie. Eine der Ektodomänen scheint eine ”tethered” (angebundene) Konfiguration aufzuweisen, während sich die andere in einem freieren Zustand befindet. Da die Anwesenheit struktureller Heterogenität in den Ektodomänen auf die Möglichkeit zweier verschiedener Bindungsstellen deutet, führte ich Ligandenbindung-Assays mit den gereinigten EGFR Dimeren durch. Das Scatchard- Diagramm zeigt eine kurviliniare, konkave Form, die charakteristisch für in vivo EGFR- Ligandenbindung ist. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Ektodomänenasymmetrie direkt in Heterogenität der Bindungsstellen übersetzt wird, was wiederum die zwei Affinitäten generiert, die in vivo zu sehen sind. Das ist das erste Mal, dass ein solches Scatchard-Diagramm mit gereinigten EGF-Rezeptoren vorgestellt wird. In dieser Arbeit zeige ich eine unerwartete Architektur des vorgeformten EGFR Dimers. Anstatt symmetrische Dimer zu formen, gehen die Ektodomänen vor der Ligandenbindung in asymmetrischer Weise zusammen. Wir hoffen, dass sich diese Entdeckung als nützlich für die zukünftige Entwicklung von Medikamenten bei der Krebsbehandlung zeigt sowie Aufschluss über die allgemeinen Mechanismen der Signaltransduktion –nicht nur von ErbB, sonder auch von anderen Rezeptoren – geben kann.
Abstract
(Englisch)
Receptor tyrosine kinases (RTKs) are a family of plasma-membrane embedded proteins that mediate cellular signalling. In humans, RTKs comprise 59 genes divided into 20 families. One of these is the family of the epidermal growth factor receptors (ErbBs or HERs), composed of four members: EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2/Neu, ErbB3/ HER3 and ErbB4/HER4. They can bind different ligands and form a wide array of homo- and heterodimers, thus generating different cellular responses. ErbB receptors are thought to trigger signalling by ligand-mediated dimerization, and are involved in pathways related to cellular growth and differentiation. Many mutations of ErbB receptors are known, and these typically lead to cell transformation and cancer.
Even though much is known about the structure and activation of ErbB receptors, we are still missing a complete picture of the molecular mechanisms that lead to the conversion of an extracellular signal into an intracellular event (the activation of the kinase domains). For example, ErbB receptors are known to exist as preformed, non- covalently linked dimers at the plasma membrane in the absence of ligand, but this association disappears when the receptors are purified. EGFR is also known to bind ligand with two apparent affinities, but only in vivo. Once the receptor is purified, only the low affinity component remains. The high affinity binding and the preformed dimers are thought to be related. These could present negative cooperativity that would explain the presence of two affinity sites. For this reason, I wanted to develop a method that allows both the structural and biochemical characterization of preformed EGFR homodimers. The challenge was to introduce a tool that allows the purification of a preformed dimer without the necessity of adding any covalent modifications, that would hinder the inherent flexibility and structure of the receptor.
In this work, I have introduced a heterodimerization tool that maintains the EGF receptors in a dimerized state in the absence of ligand throughout the purification procedure. This tool consists of a de novo designed heterodimeric coiled-coil, termed E3/K3. This pair has been previously described, but never fused to a protein. For this reason, I have tested the behaviour of the E3/K3 pair when fused to two model proteins, Venus and ECFP. By using affinity tag purification, gel filtration, isothermal titration calorimetry (ITC) as well as FRET, I have showed that the E3/K3 pair is very well suited for the heterodimerization of two proteins. It is extremely specific, and the interaction is able to withstand the purification procedure.
The E3/K3 dimerization module was then transplanted to EGF receptors, and ex- pressed in CHO cells. The results show that EGFR can be purified in the absence of ligand in a dimeric form, and still bind ligand and possess kinase activity. Besides, the sample is extremely clean and can be readily used for structural studies using single- particle negative staining. I present a three-dimensional reconstruction of a preformed EGFR homodimer, which, to our knowledge, is the first one of a near-full length RTK. Strikingly, the EGFR preformed dimer presents ectodomain asymmetry. One of the ectodomains seems to exist in a tethered configuration while the other appears to be in a more extended state.
Since the presence of a structural heterogeneity in the ectodomains points to the possibility of two different binding sites, I performed ligand binding assays with the purified EGFR dimers. The Scatchard plot shows a curvilinear, concave-up shape, characteristic of ligand binding to EGFR in vivo. Thus, it is very probable that the ectodomain asymmetry directly translates into a heterogeneity of binding sites, hence generating the two affinities seen in vivo. This is the first time that such a Scatchard plot is seen with purified EGF receptors.
With this work, I have shown that the architecture of preformed EGFR dimers differs from what was expected. Instead of forming symmetric dimers, the ectodomains associate in an asymmetric fashion prior to ligand binding. We hope that this discovery will prove to be useful for the future development of anticancer drugs, as well as shed light on the general mechanisms of signal transduction, not only of ErbBs, but also of other receptors.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
EGF receptor structure dimers
Schlagwörter
(Deutsch)
EGF-Rezeptor Struktur Dimere
Autor*innen
Jesus Fernandez Rodriguez
Haupttitel (Englisch)
Biochemical and structural characterization of preformed EGF receptor dimers
Paralleltitel (Deutsch)
Biochemische und strukturelle Charakterisierung von vorgeformten EGF-Rezeptor Dimeren
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
144 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Kristina Djinovic Carugo ,
Stephen G. Aller
AC Nummer
AC08936719
Utheses ID
15354
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |