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Characterization of the PHA-Operon of H. hispanica and H. marismortui in N. magadii
Daniel Philipp Kiesenhofer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.17181
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29296.02812.619059-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ziel dieser Diplomarbeit war das PHA-Operon von H. hispanica bzw. H. marismortui
in N. magadii zu transformieren und PHA-Synthese nachzuweisen. Das PHA-Operon
besteht aus dem nativen Promotor und den beiden Untereinheiten der PHA-Synthase
PhaC (53 kDa) und PhaE (20,6 kDa). Was die beiden Haloarcula Spezies mit N.
magadii verbindet ist die hohe Salzkonzentration, die sie zum Leben benötigen, 4
M NaCl. Was sie trennt ist ihr bevorzugter pH-Wert, Haloarcula Spezies wachsen
bei neutralem, N. magadii bei basischem pH (zwischen 9 und 11). Die Fähigkeit
protelytisch zu wachsen ist N. magadii vorbehalten, während Haloarcula Spezies
saccharolytisch wachsen und auch nur unter Mangelbedingungen aus Glukose PHA
synthetiseren.
Die Transformation von N. magadii erfolgte mit unterschiedlichen Konstrukten, einerseits
ein stabiles Plasmid, andererseits ein Vektor, der nur durch homologe Rekombination
stabil in der Population verankert wird. Die Konstrukte umfassten die
beiden PHA-Operone jeweils mit dem nativen und dem 16S rDNA Promotor aus N.
magadii.
Die beiden Untereinheiten der PHA-Synthase wurden überexprimiert und aufgereinigt,
um Antikörper herstellen zu lassen. Im Fall von PhaE war dies erfolgreich
und so konnten Western Blots durchgeführt werden. Diese zeigten, dass die kleine
Untereinheit, und somit auch die große Untereinheit, in allen Transformanten exprimiert
wurde. Die Positivkontrollen, die beiden Haloarcula Spezies, exprimierten
PhaE entgegen der Annahme jedoch nur im Vollmedium, nicht im Mangelmedium.
Parallel dazu wurde der Nachweis von PHA betrieben. Dies wurde mittels Färbung
mit Nile Blue und anschließender Untersuchung unter dem Fluoreszenz- und
Konfokalmikroskop versucht. Die Positivkontrollen synthetisierten entgegen den Erwartungen
im Mangelmedium kaum, aber im Vollmedium viel PHA. Auch die Transformanten
zeigten spezifische Färbung, daher wurde in weiterer Folge eine Gaschromatographie
durchgeführt, um die gemachten Beobachtungen zu verifizieren. Die GC
bestätigte die Beobachtungen der Mikroskopie betreffend der Positivkontrollen. Jedoch
wurde wahrscheinlich zu wenig Biomasse verwendet, sodass bei einer Kontrolle
nur ein minimaler Ausschlag detektiert werden konnte. Was die Transformanten betraf,
so konnte in keiner PHA nachgewisesen werden.
Möglicherweise fehlt in N. magadii die beta-ketoacyl-ACP Reduktase, ein Enzym, das,
der PHA-Synthase vorgeschaltet, das Substrat für diese katalysiert. Dies wäre ein
Ansatzpunkt für zukünftige Projekte rund um dieses Thema.
Abstract
(Englisch)
The aim of this diploma thesis was to transform the PHA synthase of H. hispanica
and H. marismortui into N. magadii. Subsequently also PHA synthesis should be
proven. The PHA operon consists of its native promoter and the two subunits of
the PHA synthase PhaC (53 kDa) and PhaE (20.6 kDa). Haloarcula species and N.
magadii live at the same high NaCl concentrations around 4 M. Haloarcula species
thrive at a neutral pH and grow saccharolytically. They synthesize PHA under starvation
from glucose. N. magadii lives at an alkaline pH between 9 and 11 and can
grow proteolytically.
For the transformation of N. magadii different strategies and constructs were employed.
On one hand a stable plasmid was used for transformation and on the other
hand a suicide plasmid which would only become stable after homolog recombination
took place. The constructs involved the two PHA synthases either with its native
promoters or 16S rDNA promoter from N. magadii.
The two subunits of the PHA synthase were overexpressed and purified for antibody
production. In case of PhaE it was successful and therefore western blots were
facilitated. The results showed that PhaE was expressed in all transformants, due to
the operon organisation probably PhaC also. The two Haloarcula species, positive
controls, expressed PhaE contrary to the expectations only in rich medium and not
in defined mineral medium.
At the same time PHA detection was promoted. First cells were stained using
Nile Blue and then they were investigated using a fluorescence and confocal microscope.
The positive controls displayed stronger PHA accumulation in rich medium
compared to defined mineral medium and contrary to the expectations. The transformants
also showed specific staining. Gas chromatography was employed to verify
or falsify the observations made by microscopy. Concerning the positive controls GC
verified the results of microscopy. PHA was detected only in rich medium but one
species only showed a minipeak, therefore probably not enough biomass was applied.
Concerning the transformants no PHA could be detected.
Possibly N. magadii misses beta-ketoacyl-ACP reductase. This enzyme is set upstream
of the PHA synthase supplying it with substrate. This might be a starting point for
future projects.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Archaea PHA H. hispanica H. marismortui N. magadii PHA-Operon PHA synthesis PHA detection Halophile
Schlagwörter
(Deutsch)
Archaea PHA H. hispanica H. marismortui N. magadii PHA-Operon PHA-Synthese PHA-Nachweis Halophile
Autor*innen
Daniel Philipp Kiesenhofer
Haupttitel (Englisch)
Characterization of the PHA-Operon of H. hispanica and H. marismortui in N. magadii
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung des PHA-Operons von H. hispanica und H. marismortui in N. magadii
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
120 S. : Ill.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
AC Nummer
AC09450408
Utheses ID
15398
Studienkennzahl
UA | 490 | | |