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Characterization of the PHA-Operon of H. hispanica and H. marismortui in N. magadii
Daniel Philipp Kiesenhofer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Angela Witte
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.17181
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29296.02812.619059-1
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Ziel dieser Diplomarbeit war das PHA-Operon von H. hispanica bzw. H. marismortui in N. magadii zu transformieren und PHA-Synthese nachzuweisen. Das PHA-Operon besteht aus dem nativen Promotor und den beiden Untereinheiten der PHA-Synthase PhaC (53 kDa) und PhaE (20,6 kDa). Was die beiden Haloarcula Spezies mit N. magadii verbindet ist die hohe Salzkonzentration, die sie zum Leben benötigen, 4 M NaCl. Was sie trennt ist ihr bevorzugter pH-Wert, Haloarcula Spezies wachsen bei neutralem, N. magadii bei basischem pH (zwischen 9 und 11). Die Fähigkeit protelytisch zu wachsen ist N. magadii vorbehalten, während Haloarcula Spezies saccharolytisch wachsen und auch nur unter Mangelbedingungen aus Glukose PHA synthetiseren. Die Transformation von N. magadii erfolgte mit unterschiedlichen Konstrukten, einerseits ein stabiles Plasmid, andererseits ein Vektor, der nur durch homologe Rekombination stabil in der Population verankert wird. Die Konstrukte umfassten die beiden PHA-Operone jeweils mit dem nativen und dem 16S rDNA Promotor aus N. magadii. Die beiden Untereinheiten der PHA-Synthase wurden überexprimiert und aufgereinigt, um Antikörper herstellen zu lassen. Im Fall von PhaE war dies erfolgreich und so konnten Western Blots durchgeführt werden. Diese zeigten, dass die kleine Untereinheit, und somit auch die große Untereinheit, in allen Transformanten exprimiert wurde. Die Positivkontrollen, die beiden Haloarcula Spezies, exprimierten PhaE entgegen der Annahme jedoch nur im Vollmedium, nicht im Mangelmedium. Parallel dazu wurde der Nachweis von PHA betrieben. Dies wurde mittels Färbung mit Nile Blue und anschließender Untersuchung unter dem Fluoreszenz- und Konfokalmikroskop versucht. Die Positivkontrollen synthetisierten entgegen den Erwartungen im Mangelmedium kaum, aber im Vollmedium viel PHA. Auch die Transformanten zeigten spezifische Färbung, daher wurde in weiterer Folge eine Gaschromatographie durchgeführt, um die gemachten Beobachtungen zu verifizieren. Die GC bestätigte die Beobachtungen der Mikroskopie betreffend der Positivkontrollen. Jedoch wurde wahrscheinlich zu wenig Biomasse verwendet, sodass bei einer Kontrolle nur ein minimaler Ausschlag detektiert werden konnte. Was die Transformanten betraf, so konnte in keiner PHA nachgewisesen werden. Möglicherweise fehlt in N. magadii die beta-ketoacyl-ACP Reduktase, ein Enzym, das, der PHA-Synthase vorgeschaltet, das Substrat für diese katalysiert. Dies wäre ein Ansatzpunkt für zukünftige Projekte rund um dieses Thema.
Abstract
(Englisch)
The aim of this diploma thesis was to transform the PHA synthase of H. hispanica and H. marismortui into N. magadii. Subsequently also PHA synthesis should be proven. The PHA operon consists of its native promoter and the two subunits of the PHA synthase PhaC (53 kDa) and PhaE (20.6 kDa). Haloarcula species and N. magadii live at the same high NaCl concentrations around 4 M. Haloarcula species thrive at a neutral pH and grow saccharolytically. They synthesize PHA under starvation from glucose. N. magadii lives at an alkaline pH between 9 and 11 and can grow proteolytically. For the transformation of N. magadii different strategies and constructs were employed. On one hand a stable plasmid was used for transformation and on the other hand a suicide plasmid which would only become stable after homolog recombination took place. The constructs involved the two PHA synthases either with its native promoters or 16S rDNA promoter from N. magadii. The two subunits of the PHA synthase were overexpressed and purified for antibody production. In case of PhaE it was successful and therefore western blots were facilitated. The results showed that PhaE was expressed in all transformants, due to the operon organisation probably PhaC also. The two Haloarcula species, positive controls, expressed PhaE contrary to the expectations only in rich medium and not in defined mineral medium. At the same time PHA detection was promoted. First cells were stained using Nile Blue and then they were investigated using a fluorescence and confocal microscope. The positive controls displayed stronger PHA accumulation in rich medium compared to defined mineral medium and contrary to the expectations. The transformants also showed specific staining. Gas chromatography was employed to verify or falsify the observations made by microscopy. Concerning the positive controls GC verified the results of microscopy. PHA was detected only in rich medium but one species only showed a minipeak, therefore probably not enough biomass was applied. Concerning the transformants no PHA could be detected. Possibly N. magadii misses beta-ketoacyl-ACP reductase. This enzyme is set upstream of the PHA synthase supplying it with substrate. This might be a starting point for future projects.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Archaea PHA H. hispanica H. marismortui N. magadii PHA-Operon PHA synthesis PHA detection Halophile
Schlagwörter
(Deutsch)
Archaea PHA H. hispanica H. marismortui N. magadii PHA-Operon PHA-Synthese PHA-Nachweis Halophile
Autor*innen
Daniel Philipp Kiesenhofer
Haupttitel (Englisch)
Characterization of the PHA-Operon of H. hispanica and H. marismortui in N. magadii
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung des PHA-Operons von H. hispanica und H. marismortui in N. magadii
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
120 S. : Ill.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,
42 Biologie > 42.49 Prokaryota
AC Nummer
AC09450408
Utheses ID
15398
Studienkennzahl
UA | 490 | | |
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