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The development of strategies to facilitate the crystallization of the prokaryotic peptide transporter YdgR

Bettina Spitzenberger

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Peggy Stolt-Bergner

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DOI

10.25365/thesis.17373

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30306.06659.941263-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Um den Mechanismus der Substrattranslokation von Transportern durch die Membran zu verstehen, sind Studien betreffend deren Struktur und die Funktion unerlässlich. Unser Labor beschäftigt sich seit längerem mit einem prokaryotischen Mitglied der Peptid Transporter (PTR) Familie von Symportern. Diese Familie ist für den Transport von Di- und Tripeptiden in die Zelle verantwortlich, transportiert aber auch Medikamente und peptid-ähnliche Stoffe. Die Strukturbestimmung von Membranproteinen ist ein schwieriges Unterfangen, deshalb wurden zwei Strategien verfolgt, um die Struktur von YdgR zu lösen. Es wurde bereits gezeigt, dass Co-Kristallisation von Membranproteinen mit monoklonalen Antikörperfragmenten (mFab) in gut streuenden Proteinkristallen resultierten können (Ostermeier, Iwata et al. 1995). Die Detergentmizelle schirmt den Grossteil des solubilisierten Membranproteins ab, was zur Beschränkung von zugänglichen Bereichen führt, die Kristallkontakte formen könnten. Im Komplex mit mFab Fragmenten werden diese Bereiche vergrößert und erhöhen die Wahrscheinlichkeit von gut geordneten Proteinkristallen. Deshalb wurden zwei konformationspezifische Antikörper gegen YdgR generiert, um sie für Co-Kristallisation zu nutzen. Die resultierenden Kristalle streuten bis 8-10 Å. Ausserdem wurde gezeigt, dass die erhöhte Thermostabilität von Proteinen die Wahrscheinlichkeit für gut streuende Kristalle verbessert (Serrano-Vega et al 2008). Nach der Mutagenese von YdgR (Nettleship et al 2008) wurden die Mutanten mit einer „high-thoughtput“ Methode auf ihre Thermostabilität getestet. Zwei Mutanten, deren Thermostabilität um wenigstens 3°C erhöht war, konnten identifiziert werden. Ein weiter Assay, der auf der Fraktion von gefalteten Protein nach einer Inkubation auf 50°C basiert, konnte zeigen, dass sowohl die Einzelmutanten als auch die Doppelmutante erhöhte Thermostabilität zeigen und ihre Toleranz für raue Detergentien wie LDAO erhöht ist. Unglücklicherweise formten die Mutanten keine Kristalle. Der Vergleich der Mutanten mit dem PTR- Transporter PepTso, dessen Struktur bereits gelöst ist (Newstead et al 2011), zeigte, dass selbst nach der Selektion von thermostabilen YdgR Mutanten aus E. coli, diese weniger thermostabil sind als das Homolog PepTso aus Shewanella oneidensis. Interessanterweise kann einer der Antikörper nur mit dem N-terminal His-tag nativen YdgR interagieren, während der zweite mAb auch mit allen Mutanten unabhängig von der Orientierung des His- tags interagieren kann. Wahrscheinlich können die thermostabilien Mutanten nur eine Konformation annehmen, in der das Antigen des ersten mAb nicht zugänglich ist. Um dies Annahme zu überprüfen, wurde die zugänglichen Lysine im nativen Protein und in den Mutanten acetyliert und das Acetylierungsmuster mit Massenspektrometrie analysiert. Die thermostabilen Mutanten scheinen hauptsächlich die „in-ward facing“ Konformation anzunehmen.

Abstract

(Englisch)

Structural and functional studies on transmembrane transporters are crucial to understanding mechanisms of substrate translocation. Our lab has begun structural studies on YdgR, a prokaryotic member of the peptide transporter (PTR) family of symporters. This transporter family takes up di-/tri-peptides, as well as many drugs and peptidomimetics. As membrane protein crystallization is inherently difficult, two strategies were used to approach this problem. First, it has been shown that co-crystallization of monoclonal antibody (mFab) fragments with membrane proteins can give rise to well diffracting crystals (Ostermeier, Iwata et al. 1995). Due to the detergent micelle surrounding the protein, membrane proteins have restricted accessible areas that are able to form crystal contacts. When in complex with mFab fragments, the accesible surface area is increased and supports the formation of crystal contacts. Therefore two conformationally specific monoclonal antibodies against YdgR were produced to use as tools to improve crystallization. Co-crystallization of the target protein YdgR with the proteolytically generated mFab fragments gave rise to crystals that diffracted to 8-10 Å. Second, improvement of protein thermostability has been shown to increase the probability of yielding crystals of membrane proteins (Serrano-Vega et al 2008). Random mutatagensis of YdgR was carried out (Nettleship et al 2008) and testing for thermostability of the target protein was performed in a high-throughput manner to identify mutants that are more thermostable and therefore may have a higher propensity to crystallize. Two mutants with an increase in thermostability of at least 3° C were identified. An additional thermostability screen, based on gel filtration analysis of the fraction of folded protein remaining after incubation at 50°C, revealed that the single mutants as well as a double mutant show increased thermostability and increased tolerance to the harsh detergent LDAO. Unfortunately the mutants did not give rise to crystals. Comparison with the PTR transporter PepTso, whose structure has been solved (Newstead et al 2011), shows that even after selection for thermostability the mutants of YdgR from E.coli are less thermostable than the homologue PepTso from Shewanella oneidensis. Most interesting, one of the generated mAb is only able to interact with N-terminally His-tagged native YdgR while the second mAb interacts with the native protein as well as with the mutants, independent of the location of the His-tag. This suggests that the thermostable mutants are locked in one conformation, in which the antigen recognized by the first mAb is not exposed. Acetylation of accessible lysine residues coupled with analysis via mass spectrometry indicates that the thermostable mutants S166G and N196K may be locked in the inward facing conformation. Additional experiments to support this conclusion are underway.

Autor*innen

Bettina Spitzenberger

Haupttitel (Englisch)

The development of strategies to facilitate the crystallization of the prokaryotic peptide transporter YdgR

Paralleltitel (Deutsch)

Strategien um die Kristallisation des Peptidtransporters YdgR zu erleichtern

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

95 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Kristina Djinovic-Carugo ,

Klaas Martinus Pos

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08947473

Utheses ID

15571

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter