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Alterations in the Gap-Junctional Protein Cx43 under conditions of Ether Lipid-Deficiency

Fatma Asli Erdem

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Johannes Berger

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30273.83849.244762-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Plasmalogene sind spezielle Ether Lipide, die sich durch eine Vinyl‐Ether‐Bindung an der sn1‐Position unterscheiden und in lipid rafts vorkommen. Der Ausfall von Plasmalogenen führt zu rhizomelischer Chondrodysplasie punctata (RCDP), einer seltenen vererbbaren Krankheit die in einigen Fällen auch von Herzdefekten begleitet ist. Letztere wurden in nicht-RCDP Patienten mit einer Herunterregulation und falschen Lokalisation von Connexin‐43 (Cx43) in Verbindung gebracht. Dieses Protein wurde in Ether Lipid‐defizienten Mäusen in reduzierten Mengen vorgefunden. Das Ziel dieser Arbeit war, eine mögliche molekulare Verbindung zwischen Ether‐Lipiden und Cx43 in RCDP Zellen sowie Ether Lipid‐defizienten Mausherzen aufzudecken. Wir konnten in unserem System nicht‐phosphorylierte und phosphorylierte Isoformen von Cx43 erkennen. Die nicht‐phosphorylierte Isoform stellt neu synthetisiertes Protein dar, während phosphorylierte Cx43 Isoformen an der Zelloberfläche oder in Gap Junctions eingebaut sind. Unsere Ergebnisse zeigen eine Dichte‐abhängige Expression von Connexin‐43. Die Cx43 Phospho‐Isoformen waren in humanen primären Kontrollfibroblasten mit der Dichte erhöht. Jedoch wurde dieser Effekt in Ether Lipid-defizienten Zellen nicht beobachtet. Zusätzlich waren in dieser Zelllinie die Proteinmengen von Cx43 im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant reduziert. Interessanterweise war diese Reduktion vor allem in den Phospho-Isoformen prominent. Zudem zeigten Immunfluoreszenzfärbungen, dass Cx43 an Stellen von Zell‐Zellkontakten lokalisiert, sodass ein kontinuierliches Signal entsteht, während diese Färbung in den primären Fibroblasten ohne Ether Lipide nicht zu finden war. Wir untersuchten auch die Raft‐Lokalisation von Cx43 durch die Isolation von Detergenzresistenten Membranen der beiden Zelllinien und fanden in Kontrollzellen den Großteil der Cx43‐Phosphoisoformen in den Raft‐Fraktionen, während in mutanten Zellen kaum welche anwesend waren. Die berichteten RCDP‐Fälle mit Herzanomalien veranlassten uns zur Überprüfung von Cx43 in Herzgeweben von Mäusen. Verglichen mit Wildtyp‐Mäusen, waren Cx43 Proteinmengen in den Herzen der Ether Lipid‐defizienten Mäuse signifikant reduziert. Zusammengefasst deutet diese Arbeit auf eine mögliche Beteiligung von Cx43 im pathologischen Ablauf des RCDP an. Damit ist es naheliegend zu vermuten, dass Cx43 in den zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Herzphänotypen von RCDP‐Patienten beteiligt sein kann. Diese Daten beschaffen genügend Information, um detaillierte Untersuchungen zu rechtfertigen.

Abstract

(Englisch)

Plasmalogens are special ether lipids that differ in having a vinyl ether bond at their sn1 position and in being abundant in membrane rafts. Plasmalogen deficiency leads to the rare inherited disorder rhizomelic chondrodysplasia punctata (RCDP) that, in some cases, is also accompanied by heart defects. In non‐RCDP patients, such cardiac defects have been associated with a downregulation and/or mislocalization of Connexin‐43 (Cx43). This protein has been shown to be reduced in fibroblasts of ether lipid‐deficient mice. The aim of the present thesis was to detect a possible molecular link between Cx43 and ether lipids in RCDP cells and hearts of mice deficient in ether lipids. We were able to distinguish the non‐phosphorylated and phosphorylated isoforms of Cx43 in our system. The non‐phosphorylated isoform represents newly synthesized intracellular protein, while phosphorylated Cx43 isoforms are at the cell surface or in gap junctions. Our results demonstrate a confluency‐dependent expression of Cx43. This protein was upregulated in human primary control fibroblasts upon confluency. However, this induction was not observed in ether lipid‐deficient fibroblasts. These cells showed a significant reduction in Cx43 protein levels compared to control. Interestingly, Cx43 was particularly reduced in its phospho‐isoforms. Furthermore, immunofluorescence staining revealed Cx43 to be localized exclusively at sites of cell‐cell contact in control cells, resulting in a continuous signal. Human primary fibroblasts lacking ether lipids did not exhibit this pattern. We also examined localization of Cx43 in rafts by isolating detergent‐resistant membranes from both primary cell lines and detected most of the Cx43 phospho‐isoforms to be in raft fractions of control cells, whereas in ether lipid‐deficient cells they were merely present. Due to the many reported RCDP cases associated with heart anomalies, mouse heart tissues were examined. Hearts of mice lacking a crucial biosynthetic enzyme for ether lipid biosynthesis also showed significantly lower amounts of Cx43. Taken together, this study points towards a possible involvement of Cx43 in the pathologic course of RCDP. It is also tempting to speculate that Cx43 might be involved in the molecular mechanisms underlying underlying the heart defects reported in RCDP patients. Thus, these data provide sufficient information to justify future detailed investigations.

Autor*innen

Fatma Asli Erdem

Haupttitel (Englisch)

Alterations in the Gap-Junctional Protein Cx43 under conditions of Ether Lipid-Deficiency

Paralleltitel (Deutsch)

Änderungen des Gap Junction Proteins Cx43 bei Ether Lipid-defizienten Bedingungen

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

72 S. : Ill.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Johannes Berger

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC09423292

Utheses ID

15816

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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