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Einfluss von Melatonin auf das Wachstum von Osteoklasten

Untersuchungen mittels eines neuen automatisierten Imageanalysesystems

Kathrin Burger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Walter Jäger

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DOI

10.25365/thesis.17742

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29291.57639.329065-8

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Aktivität der Knochen-aufbauenden Osteoblasten und der Knochen-abbauenden Osteoklasten bewirkt einen kontinuierlichen Knochenumbau. Dies ist nicht nur wichtig, um den Konchen funktionsfähig zu erhalten sondern trägt auch dazu bei, den Calciumhaushalt auszugleichen. In dieser Arbeit wurde die Bildung von Osteoklasten untersucht. Osteoklasten sind mehrkernige Zellen, welche sich über Vorläuferzellen durch die Wirkung von RANKL und M-CSF aus hämatopoietischen Stammzellen bilden. Zur Aufrechterhaltung des Gleichgewichtes zwischen Knochenauf- und -abbau spielt das RANK / RANKL / OPG-System eine entscheidende Rolle. Ist dieses Gleichgewicht gestört, und überwiegt die Zahl an knochenabbauenden Osteoklasten, kann es zu Krankheiten wie der Osteoporose kommen. Sie spielen auch bei den osteoklastischen Metastasen eine wichtige Rolle. In vitro und in vivo Untersuchungen zeigten, dass das Hormon Melatonin, synthetisiert aus der Aminosäure Tryptophan, eine hemmende Wirkung auf den Knochenabbau ausübt. Es wird vorwiegend in der Zirbeldrüse, aber auch in der Retina, dem Knochenmark und anderen Organen gebildet. Die Serumkonzentration von Melatonin unterliegt tageszeitlichen Schwankungen, wobei diese bei Dunkelheit 10-100-fach erhöht ist. Seine Wirkungen entfaltet Melatonin über verschiedene Rezeptoren. MT1 und MT2 sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren und kommen in Säugetieren vor, wohingegen MT3 bei Nagetieren entdeckt wurde und oxidoreduktive Eigenschaften aufweist. Zahlreiche physiologische Funktionen unterliegen dem Einfluss von Melatonin. Durch seine tageszeitlichen Schwankungen reguliert es verschiedene Körperfunktionen, wie z.B. Schlaf, Appetit, Körpergewicht, Körpertemperatur etc. Abgesehen von seinen Rezeptor-vermittelten Effekten, wirkt Melatonin auch als Antioxidans. Es neutralisiert nicht nur eine Vielzahl an freien Radikalen, sondern steuert auch eine Reihe antioxidativ wirkender Enzyme. Mit steigendem Alter sinkt die Konzentration an Melatonin, wodurch ein Zusammenhang zwischen Melatonin und altersbedingten Krankheiten, z.B. Osteoporose, vermutet wird. Da hohe Melatonin-Konzentrationen im Knochenmark zu finden sind und der Knochen einem 24-Stunden-Rhythmus unterliegt, kann von einem Einfluss von Melatonin auf die Knochenzellen ausgegangen werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Melatonin auf die Osteoklastenbildung aus Knochenmarkszellen der Maus mittels Immunfluorezenzfärbung der Osteoklasten und anschließender Analyse mithilfe einer TissueFaxs / TissueQuest Software untersucht. Als Kontrolle wurde die klassische Methode zur Erkennung und Quantifizierung von Osteoklasten mittels TRAP-Färbung verwendet, die allerdings sehr ungenaue Ergebnisse liefert, und keine Bestimmung aller Zellen in der Kultur zulässt. Weiters erlaubt diese Methode keine nachfolgende Untersuchung der identifizierten Osteoklasten mittels weiterer Immunfluorenszenz- bzw. Immunhistochemieuntersuchungen. Hier bringt die Automatisierung der Analyse der mikroskopischen Bilder absolute Vorteile und konnte nun auch für mehrkernige Zellen, wie Osteoklasten, etabliert werden. Melatonin-Konzentrationen, ausgehend von therapeutischen (µM) bis hin zu physiologischen (nM) Konzentration, wurden in den Studien verwendet. Es wurde eine automatische Analyse-Software zur Auszählung von Osteoklasten in einer Zellkultur entwickelt. Nach Immunfluoreszenzfärbung konnte mithilfe der Software nicht nur die Anzahl der Osteoklasten in der Kultur, sondern auch deren Fläche sowie das Verhältnis von Osteoklasten zu Osteoklastenvorläuferzellen bestimmt werden. Weiters wurden die Zellen auch für den Nachweis des Melatoninrezeptors untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Abnahme der Zellzahl, sowie der Zellfläche bei physiologischen Konzentrationen im Vergleich zu pharmakologischen Melatonindosen. Im nächsten Schritt wurde mithilfe der Immunfluoreszenz-Färbung das Vorkommen und die Lokalisation des Melatonin-Rezeptors MT1 in Osteoklasten und Präosteoklasten nachgewiesen. Auch auf mRNA Ebene wurde mittels RT-PCR unter Anwendung von TaqMan-Sonden das Vorkommen von MT1 nicht aber von MT2 bestätigt. In Anwesenheit von Melatonin scheint die Expressionsrate des Rezeptors abzunehmen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass eine neue Analysen-Software zur automatischen Detektion von mehrkernigen Zellen wie den Osteoklasten erfolgreich angewendet und evaluiert wurde. Mithilfe dieser Methode konnte eine Abnahme sowohl der Osteoklasten-Zahl als auch der –Fläche in Anwesenheit von Melatonin festgestellt werden.

Abstract

(Englisch)

Bone-forming osteoblasts and bone-degrading osteoclasts work together to maintain the hoemostasis of bone turnover. Furtehrmore, they are important of the reconstruction of damaged bone regions and the compensation of variations in the calcium balance of the body. In this diploma thesis the formation of osteoclasts has been investigated. Osteoclasts are large bone-resorbing cells, which contain more than 3 nuclei and the enzyme tartrat-resistance alkaline phosphatase (TRAP). They are formed by the fusion of cells from the monocyte-macrophage line of precursor cells. Osteoclast formation requires the presence of RANK ligand (RANKL) and M-CSF. To maintain the balance between bone formation and bone resorption, the RANK / RANKL / OPG system is playing a decisive role. Any disturbance of this balance leads to bone disease, such as osteoporosis, which is quite frequently observed, particularly, in elderly women. Therefore, compounds, which can inhibit bone resorption are of great pharmacological interest. In vitro and in vivo studies showed that melatonin, a derivate of the aminoacid tryptophan, inhibits bone resorption. It is mainly synthesized by the pineal gland. However, it is also be produced extrapineal, e.g. by bone marrow cells, and endocrine cells in the intestine and other organs. Pineal melatonin secretion is subjected to a circadian rhythm and its production is inhibited by light and stimulated by darkness. Melatonin exerts its effects through various receptors. MT1 and MT2 are G-protein coupled receptors in mammals, while MT3 was discovered in rodents and its stimulation may induce antioxidative effects. Melatonin is responsible for many biological effects. It is part of the system that regulates the sleep-wake cycle. Other established effects of melatonin are for example his activity as antioxidant or its interaction with the immune system. Melatonin not only neutralises a variety of free radicals but also induced antioxidative enzymes. In humans, during aging, the concentration of melatonin decreases and this might lead to an increase in the concentration of free radicals leading to cell damage. Melatonin production is highest in adolescents during the bone growth and skeletal development suggesting that it may have an influence on skeletal growth and bone formation. Additionally, bone metabolism underlies a circadian rhythm, which might also be influenced by pineal melatonin secretion. To study these processes, the influence of melatonin on osteoclast formation was investigated. Osteoclasts were generated from mouse bone marrow cells and immunofluorescence staining of osteoclast markers were done to identify and quantify these cells in an automated microscopic analysis. Up to now OC were detected in culture using a histochemical method of TRAP staining. The disadvantage of this method is that osteoclasts and its precursor cells have to be counted manually under the microscope. With this manual method, the cell number varies to a great degree not only in between the regions on the microscopic preparation, but also in between the human experts. Furthermore, nor further analysis of potential target on the identified osteoclast is possible. To overcome these problems an automated quantification system was developed. After immunofluorescence staining of targets like the calcitonin receptor and tubulin on the cells, the cell preparations were subjected to a newly developed automated quantification system. Cell numbers as well as cell areas of all cells, osteoclasts and non-osteoclasts were quantified. The cell number showed a significant reduction of osteoclast formation at physiological (nM) melatonin levels compared to pharmacological levels of the hormone (µM). This was also seen for the area of cells. Different concentrations of melatonin also had an influence on the mRNA expression of melatonin receptors. MT1, which is only poorly expressed on these cells showed a tendency to decrease in the presence of melatonin. This suggests a correlation between the expression of MT1 and melatonin levels. No expression of MT2 was detectable. In the summary, the new automatic quantification system for the detection and area determination of osteoclasts in culture proved to be successful and let to the conclusion that the number and area of osteoclasts is reduced in the presence of melatonin.

Autor*innen

Kathrin Burger

Haupttitel (Deutsch)

Einfluss von Melatonin auf das Wachstum von Osteoklasten

Hauptuntertitel (Deutsch)

Untersuchungen mittels eines neuen automatisierten Imageanalysesystems

Paralleltitel (Englisch)

Influence of melatonin on osteoclast formation: investigation with a new automated quantification system

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

85 S.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Walter Jäger

Klassifikation

44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika

AC Nummer

AC08909888

Utheses ID

15903

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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