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Regulation of DNA- and Chromatin-associated proteins through microRNAs in tumourigenesis
Martina Diem
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gerda Egger
DOI
10.25365/thesis.17745
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29891.58453.577065-1
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das anaplastische großzellige Lymphom (Englisch: Anaplastic large cell lymphoma, ALCL) ist eine Subform der Non-Hodgkin-Lymphome mit T-lymphatischem Zellursprung und tritt am häufigsten in der Kindheit auf. EZH2 (enhancer of zeste homologue-2), die enzymatische Untereinheit von PRC2 (Polycomb repressive complex-2), ist sowohl in ALCL Zelllinien, als auch in Gewebsproben von ALCL Patienten deutlich überexprimiert. EZH2 hat die Funktion einer Histon-Methyltransferase (HMT) und setzt die repressive Trimethylierung von H3K27. Die erhöhte Expression von EZH2 führt zu einer unkontrollierten Stilllegung essentieller Gene, darunter diverse Tumorsuppressoren und Transkriptionsfaktoren. Weiters wurde gezeigt, dass die Expression von miRNA-101, einem negativen Regulator von EZH2, in ALCL Zelllinien signifikant herabgesetzt ist. Im vorliegenden Projekt versuchten wir, die EZH2 Expression in den Zelllinien durch direkten siRNA-Knockdown, global über den Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep) oder mittels Überexpression der miRNA-101 zu reduzieren. Durch die fehlende enzymatische Aktivität von EZH2 erwarteten wir, dass die repressiven Histonmodifikationen zurückgehen würden. Zellen würden im Zellzyklus arretieren, die Proliferation würde deutlich zurückgehen und Zellen würden vermehrt in Apoptose gehen. Für unsere in vitro Versuche arbeiteten wir mit zwei ALK+ ALCL Zelllinien Karpas-299 und SR786, sowie einer ALK- Zelllinie Mac-2a. Nach EZH2 siRNA Behandlung, konnten wir einen deutlichen Rückgang der EZH2 Expression sowohl auf mRNA- als auch Proteinebene feststellen. Es gab jedoch weder einen signifikanten Anstieg in der Apoptose, noch arretierten die Zellen im Zellzyklus. Ausschließlich Karpas-299 zeigte eine leicht verminderte Zellproliferation. Die Behandlung der Zellen mit DZNep führte zu einem starken Anstieg der Apoptose, Zellproliferation war signifikant reduziert und die Zellen arretierten in der G2/M Phase. Die Überexpression der miR-101 zeigte keinen reduzierte Expression auf mRNA- oder Proteinebene und nur einen schwachen Rückgang der Proliferation.
Wir schlussfolgern daraus, dass die epigenetische Reprogrammierung nicht ausschließlich von EZH2, sondern offensichtlich noch anderen Histon-Methyltransfasen und Faktoren abhängt, welche erst durch die globale Behandlung mit DZNep ausgeschaltet werden konnten.
Abstract
(Englisch)
Anaplastic large-cell lymphoma (ALCL) is an aggressive T-cell non-Hodgkin lymphoma, which has its peak incidence in childhood. It was shown that enhancer of zeste homologue-2 (EZH2), the enzymatic subunit of Polycomb repressive complex-2 (PRC2), is overexpressed in human ALCL cell lines and tissue patient samples when compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and normal lymphnode tissue. EZH2 carries histone methyltransferase-(HMT)-activity within its SET domain and as such its major function is the trimethylation of H3K27, which is a repressive histone mark. High levels of EZH2 contribute to epigenetic reprogramming in cancer by indiscriminately silencing a cohort of genes, among them tumour suppressors and transcription factors. Additionally, miRNA-101, which is known to directly target EZH2, was found to be downregulated in ALCL cell lines. In the current project we aimed to reduce the levels of EZH2 either by direct siRNA knockdown, indirectly through global inhibition of histone methylation using the inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep) or via overexpression of the aberrantly downregulated miRNA-101. We hypothesized that all three approaches would reduce not only EZH2 but also the level of repressive histone marks. This, in turn, would enable the reactivation of genes that were abnormally silenced during cancer progression and would cause attenuated cell proliferation, cell cycle arrest and apoptosis of ALCL cell lines. We used two anaplastic lymphoma kinase positive (ALK+) cell lines Karpas-299 and SR786 and the ALK- ALCL cell line Mac-2a for our in vitro studies. When we treated the cell lines with EZH2 small interfering RNA (siRNA) we found both mRNA and protein levels of EZH2 to be highly reduced. Generally, cells did not arrest in the cell cycle or show a significant increase in apoptosis. Only Karpas-299 appeared to be less proliferative. In contrast, DZNep significantly induced apoptosis in all three cell lines and led to a cell cycle arrest in G2/M phase. Overexpression of miR-101 did not result in a reduction of EZH2 mRNA or protein level. Cells appeared to be less proliferative, though.
We conclude that epigenetic silencing is not dependent on EZH2 alone but does involve other HMTs, which can be targeted by the global inhibitor DZNep.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Epigenetics EZH2 ALCL microRNAs
Schlagwörter
(Deutsch)
Epigenetik EZH2 ALCL microRNAs
Autor*innen
Martina Diem
Haupttitel (Englisch)
Regulation of DNA- and Chromatin-associated proteins through microRNAs in tumourigenesis
Paralleltitel (Deutsch)
Regulation von DNA- und Chromatin-assoziierten Proteinen durch microRNAs in der Tumorigenese
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
57 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Gerda Egger
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC09420837
Utheses ID
15906
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |