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Investigation of the 2A protease of human rhinovirus 1A and 14

Martina Aumayr

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Tim Skern

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DOI

10.25365/thesis.18067

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29094.24266.520955-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Humane Rinoviren (HRV), welche zu der Gruppe der Picornaviridae gehören, sind die Erreger die Schnupfen und Erkältung beim Menschen erzeugen. Die sehr kleinen Viren besitzen keine Lipidschicht als Hülle und weisen die Symmetrie eines Ikosaeders auf. Als genomisches Material besitzen sie eine einzelsträngige RNA mit positiver Polarität, die nur einen offenen Leserahmen besitzt. Von diesem wird ein langes Polyprotein abgelesen, das sogleich von viralen Proteasen prozessiert wird um fertig entwickelte, virale Proteine zu erhalten. In HRV wird der erste Schritt dieser Prozessierung von der Chymtrypsin-ähnlichen Protease 2Apro durchgeführt, die sich selbst in einer intramolekularen Reaktion zwischen dem C-Terminus des vorrangehenden Proteins VP1 und ihrem eigenen N-Terminus abspaltet. In dieser Arbeit wird die unterschiedliche Substrat-Spezifität von HRV1A und HRV14, zwei aus unterschiedlichen genetischen Gruppen stammenden HRV (A und B), untersucht. Die Aminosäuresequenz der Spaltungsstelle der 2Apro dieser beiden HRVs ist besonders unterschiedlich. Am Anfang analysieren wir den Effekt unterschiedlicher Mutationen in der Schnittstelle auf die Selbstprozessierungsreaktion. Dabei finden wir heraus, dass die 2Apro von HRV1A nicht in der Lage ist, die Schnittstelle der 2Apro von HRV14 zu akzeptieren, wenn sie gänzlich ausgetauscht wird. Wir beobachten den Spaltungsprozess während der Translation mit Hilfe von Kaninchen Retikulozytenlysaten. Weiters zeigen wir, dass diese vielen Mutationen in der Spaltungsstelle nicht nur die Selbst-Prozessierung in vitro stark beeinflussen, sondern auch kein viraler Nachkomme nach der Transfektion der entsprechenden RNA in HeLa Zellen generiert werden kann. Im Rahmen dessen, demonstrieren wir, dass Veränderungen auf beiden Seiten der Spaltungsstelle notwendig sind, um die proteolytische Aktivität in vitro zu stoppen. Wenn man nur eine Seite rechts oder links des Spaltungspunktes austauscht erhält man lediglich eine zeitverzögerte Selbst-Prozessierung in vitro. Im nächsten Schritt, versuchen wir die minimale Anzahl an Aminosäuren, welche notwendig sind um die proteolytische Aktivität der 2Apro von HRV1A zu stoppen, herauszufinden. Wir zeigen, dass die Veränderung von den Aminosäuren an den Stellen P2, P1 (Threonin und Alanin) und P2‘ (Prolin) der HRV1A 2Apro Prozessierungsstelle, wenn sie durch die entsprechenden Aminosäuren der HRV14 2Apro an diesen Stellen (Serin, Tyrosin und Leucin) ausgetauscht werden, ausreichen um die Selbst-Prozessierung zu inhibieren. Diese nicht-optimale Spaltungsstelle wird in den kompletten HRV1A Klon eingefügt. Daraufhin werden HeLa Zellen mit dieser viralen RNA transfiziert. Es gelingt uns zwei unterschiedliche Arten von sogenannten Fluchtmutanten als Antwort auf die Spaltungseinschränkung der veränderten Spaltungsseite, zu isolieren. Die meisten Fluchtmutanten haben anstelle des Tyrosins an der P1 ein Cystein. Dies ist durchaus erstaunlich, da in vorangegangenen Studien ein Tyrosin an dieser Stelle der Spaltungsseite der HRV2 2Apro, die sehr ähnlich wie die HRV1A 2Apro ist, von dieser ausgezeichnet akzeptiert wurde (Sommergruber et al., 1992). In anderen Mutanten konnten wir eine Rückänderung von Leucin zur ursprünglichen Aminosäure, dem Proline, beobachten. Zusätzlich vertauschen wir das stark konservierte Glycin an der Stelle P1‘ mit der nächst größeren Aminosäure, dem Alanin. Auch diese Veränderung verhindert die Spaltungsreaktion der 2Apro von HRV1A in vitro. Alle isolierten Fluchtmutanten haben dieses Alanin zurück zu Glycin gewandelt. Diese in vivo Experimente demonstrieren, dass Glycin die einzig akzeptierte Aminosäure an dieser Stelle in der intramolekularen Spaltung der 2Apro von HRV1A ist. In unserem Model dreht das Tyrosin an der Stelle 85 in der HRV 2Apro, nach der Bindung des Substrats und der darauf folgenden Bildung einer Wasserstoffbrücke zwischen dem Threonin an der Stelle P2 des Substrats und dem Serin an der Stelle 83 des Enzyms hinaus und blockiert somit irgendeine umfangreichere Aminosäure als Glycin an der P1‘ Stelle. Eine größere Aminosäure als Alanin wird zusätzlich auch von Leucin an der Stelle 19 blockiert. Jedoch wäre Alanin klein genug um nicht von diesem Leucin blockiert zu werden. Darüber hinaus beschäftigen wir uns auch mit der 2Apro von HRV14, da vorrangegangene Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität der 2Apro von dem benachbarten Protein 2B in vitro beeinflusst wird (Kirkegaard und Neubauer, pers.comm.). Wir erhofften uns, durch die Transfektion dieser RNA, welche die Mutation I94N im 2B Protein erhielt, Fluchtmutanten isolieren zu können, welche uns einen Hinweis auf strukturell wichtige Aminosäuren geben. Wir zeigen jedoch, dass die Aktivität dieser 2Apro in vivo nicht von der Mutation im 2B Protein (I94N) beeinflusst wird. Wir können keinen Unterschied zwischen dieser Mutante und dem HRV14 Wildtyp feststellen, weder in Zusammenhang mit den Erscheinungsformen der viralen Plaques noch im Wachstums. Jedoch können wir zwei Fluchtmutanten isolieren. Da aber auf der einen Seite kein Wachstumsdefekt der Einzel-2B-Mutante festgestellt werden kann, und auf der anderen Seite die Fluchtmutanten eine reduzierte Wachstumsrate aufweisen, schließen wir daraus, dass diese Mutationen aufgrund der natürlichen Evolution eingefügt wurden und nichts mit unserer eingefügten Mutation zu tun haben. Außerdem haben weitere Experimente gezeigt, dass die HRV14 2Apro ein Arginin (anstatt Tyrosin) an der Stelle P1 der Spaltungsstelle nicht akzeptiert (Sousa et al., 2006). Daher untersuchen wir die Beeinflussung dieser Mutation (Y289R in VP1) in vivo und versuchen erneut Fluchtmutanten zu isolieren. Ein Unterschied in der Größe der Plaques nach der Transfektion kann festgestellt werden. Diese Mutante zeigt deutlich kleinere virale Plaques als der HRV14 Wildtyp. Zusätzlich ist die Wachstumsrate nicht nur etwas verzögert, es kann auch nie die maximale Ausbeute an Virus erreicht werden. Da jedoch der Unterschied nur ein Log beträgt, kann dies nicht vollständig den äußerst kleinen Durchmesser der Plaques erklären. Wir vermuten allerdings, dass diese Mutation zu einem zusätzlichen Defekt in der viralen Ausbreitung oder der Lyse führt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es notwendig ist beide Seiten der HRV1A 2Apro Spaltungsstelle auszutauschen um die intramolekulare Spaltung zu inhibieren. Jedoch ist es in vivo ausreichend nur eine Seite zu verändern, um die proteolytische Aktivität der HRV1A 2Apro wiederherzustellen. Wir zeigen außerdem, dass ein Cystein an der Stelle P1 von der HRV1A 2Apro in vivo akzeptiert wird. Obwohl die Mutation im VP1 Protein (Y289R) in vitro zu einer Inaktivierung der HRV14 2Apro geführt hat, zeigen wir dass die HRV14 2Apro mit dieser Mutation in vivo aktiv ist. Jedoch können wir eine Veränderung der Plaquegröße feststellen, die wir auf das Vorhandensein von Arginin anstelle des Tyrosins an der Stelle P1 zurückführen. Daraus folgern wir, dass weitere Erforschungen bezüglich der Substratspezifität der 2Apro von HRV1A und HRV14 notwendig sind. Bis jetzt kann man allerdings sagen, dass beide Proteasen eine unterschiedliche Substratspezifität aufweisen, und man wahrscheinlich spezifische Inhibitoren gegen jede dieser Proteasen herstellen wird müssen um den Schnupfen zu behandeln.

Abstract

(Englisch)

Human rhinoviruses (HRV), belonging to the family Picornaviridae, are small, non-enveloped viruses with an icosahedral capsid and are one of the main causative agents of the common cold. After infection, the single-stranded RNA genome of positive sense containing one large open reading frame is directly translated into a polyprotein, which is subsequently processed to yield mature viral proteins. The first cleavage event is performed by the chymotrypsin-like proteinase 2Apro in HRVs which cleaves between the C-terminal of the preceding protein VP1 and its own N-terminus. Here, we investigate the different substrate specificities of the 2Apro of HRV1A and HRV14, two human rhinoviruses from the different genetic groups, A and B, that show a great variation in the amino acid sequence at the cleavage site of the 2Apro. Initially, we analyzed the effect of mutations in the cleavage site on the self-processing. We found that HRV1A 2Apro is not able to accept the full HRV14 2Apro cleavage site in vitro as monitored by translation in rabbit reticulocyte lysates (RRL). It was further shown that these multiple mutations also severely impair the self-processing in vivo, as no viral offspring could be generated after the transfection of corresponding RNA in HeLa cells. Subsequently, we demonstrated that substitutions on both side of the cleavage junction are necessary to stop proteolytic processing in vitro. Mutating residues on only one side of the 2Apro cleavage junction resulted only in a slightly delayed self-processing in vitro. In the next step, we tried to find the minimal number of HRV14 residues required to abrogate proteolytic activity of HRV1A 2Apro. We showed that changing residues P2, P1 (threonine and alanine) and P2’ (proline) at the 2Apro cleavage junction of HRV1A with corresponding residues of HRV14 (serine, tyrosine and leucine, respectively) was enough to prevent the HRV1A 2Apro from processing. This sub-optimal cleavage site was introduced into a HRV1A full length clone and HeLa cells were transfected with viral RNA. We were able to identify several representatives of two different escape mutants in response to this cleavage site. Most escape mutants had changed tyrosine at P1 to cysteine, which was rather surprising, as tyrosine was normally very well accepted at this position in the wild-type HRV2 2Apro (HRV1A is closely related to that of HRV2) cleavage (Sommergruber et al., 1992). Another response was to mutate leucine, at P2’, back to the wild type proline. In addition, we exchanged the highly conserved glycine at position P1’ with the slightly larger amino acid alanine which also completely stopped the self-processing reaction of the HRV1A 2Apro in vitro. All escape mutants isolated had reverted alanine back to the wild type glycine. These in vivo experiments demonstrate that glycine is the only amino acid accepted at this position in the cis cleavage reaction of HRV1A 2Apro. In our model, the HRV2 2Apro tyrosine 85, which is rotated after the binding of the substrate to the enzyme, and the subsequent formation of a hydrogen bond between threonine at position P2 (substrate) and serine 83 (enzyme) would block the access of any bulkier molecule at the P1’ site other than glycine. Any residue bigger than alanine would also be blocked by leucine 19; however, alanine would be small enough to not be blocked by leucine 19. As previous results have suggested that the activity of the 2Apro is influenced by the neighboring protein 2B in vitro (Kirkegaard and Neubauer, both pers.comm.), we aimed to transfect HeLa cells with the RNA containing the mutation I94N in the 2B in order to possibly be able to isolate escape mutants. However, we showed that the activity of the HRV14 2Apro is not influenced in vivo by the 2B I94N mutation. We could not detect any difference in vivo neither in regard to plaque phenotypes nor to growth kinetics compared to wild type HRV14. We further isolated two escape mutants having an additional mutation in the 2Apro (M17T and P4H). These second site revertants showed reduced growth kinetics compared to wild type HRV14 and single HRV14 2B I94N mutant. Therefore, we concluded that these mutations were probably introduced incidentally by the error-prone RNA polymerase. Furthermore, previous experiments have shown that HRV14 2Apro is not able to accept an arginine (in place of a tyrosine) in the P1 position of the cleavage site (Sousa et al., 2006). We therefore again tried to transfect HeLa cells with RNA containing the mutation Y289R in the VP1 in order to search for escape mutants. Here, we showed that the activity of the HRV14 2Apro is influenced in vivo by the VP1 Y289R mutation also. Much smaller plaques were observed when transfecting cells with the VP1 Y289R mutant than with the wild type HRV14. In addition, viral growth was not only delayed but did also not reach the same amount of maximum yield. However, the difference was only about 1 log, which does not explain the very small plaque sizes of this mutant. We therefore assume that this mutation might lead to a defect in spreading or lysis as it affects the sequence of the capsid protein VP1. The work in this thesis shows that exchanging combinations of residues on both side of the cleavage junction are necessary to inhibit the intramolecular cleavage of the HRV1A 2Apro. However, the replacement of one side is enough to recover proteolytic activity of this enzyme. We show that cysteine at the position P1 of the cleavage junction is accepted by the HRV1A 2Apro in vivo. Although the VP1 Y289R mutation was shown to inactivate the HRV14 2Apro in vitro, we demonstrate that is not the case in vivo. However, a small plaque phenotype can be observed which might be due to the presence of arginine at the P1 position of the cleavage junction of HRV14 2Apro. We conclude that it is further necessary to investigate substrate specificity of both HRV1A and HRV14 2Apro. However, from what we can say so far, both proteases display distinct substrate specificities; thus, specific inhibitors will be necessary for each protease if they are to be used to treat the common cold.

Autor*innen

Martina Aumayr

Haupttitel (Englisch)

Investigation of the 2A protease of human rhinovirus 1A and 14

Paralleltitel (Deutsch)

Untersuchung der 2A Protease der menschlichen Rhinoviren 1A und 14

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

97 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Tim Skern

Klassifikation

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC10748060

Utheses ID

16177

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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