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L-Carnitine and its transcriptional modulation
Klemens Kienesberger
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Reinhold Hofbauer
DOI
10.25365/thesis.18070
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29254.53251.180466-1
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
L-Carnitine ist ein semi-essentieller Nährstoff welcher aus den Aminosäuren Methionin und Lysin synthetisiert und mit der Nahrung aufgenommen wird. Besonders im Energiestoffwechsel erfüllt L-Carnitine wichtige Aufgaben. Es ermöglicht den Transport von langkettigen Fettsäuren (C16-C18) aus dem Zytosol in die mitochondrielle Matrix, wo diese Fettsäuren im Rahmen der β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut und folglich dem Krebszyklus zugeführt werden.
L-Carnitine hat jedoch auch einen Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität von verschiedensten Genen im gesamten Genom. (Litzlbauer et. al, 2006). Besonders die Menge an mRNA der humanen Acyltransferase-Gene CRAT, CPT1a und CPT2 werden nach Gabe von L-Carnitine hochreguliert. (Godárová et al, 2005). In dieser Diplomarbeit war es mir möglich diesen Effekt auch in der murinen Leberzelllinie TIB73 nachzuweisen. Durch quantitiative Real-Time PCR konnte ein bis zu 2-facher Anstieg der mRNA Menge des Gens der Carnitine-Acetyltransferase 4 Stunden nach Gabe von 80µM L-Carnitine nachgewiesen werden.
In Vorarbeiten von Aniko Ginta Pordes konnte mittels Reportergen-Assays diejenige Gensequenz eingegrenzt werden welche für diesen „Carnitine-Effekt“ verantwortlich ist. Diese ist innerhalb von 342nt proximal des ersten Exons lokalisiert. Innerhalb dieser Sequenz konnten mittels theoretischer Promoteranalyse zahlreiche Bindungsstellen möglicher Transkriptions-faktoren definiert werden. Darunter fanden sich Consensus-Sequenzen für nukleare Faktoren wie Sp1, RXR, PPAR und Creb.
Mittels MobilityShift Assays wurden diese Kandidaten überprüft. Die deutlichsten Effekte wurden bei der Analyse eines RXR Elements beobachtet, wobei in Supershift Experimenten besonders nach Gabe von PPARα und LXRα Antikörpern ein Abschwächungseffekt ausgemacht werden konnte. Der Einfluss von PPARα auf die Regulation der Expression des CRAT Gens konnte weiters mittels qPCR nachgewiesen werden, nachdem die Gabe von Fibraten zu eindeutigem Ansteigen der Expressionslevels von CRAT führte.
Abstract
(Englisch)
L-carnitine, an amino acid-like compound synthesized from lysine and methionine, is essential for energy metabolism. It mediates the transport of long-chain fatty acids prone for ß-oxidation across the inner mitochondrial membrane into the matrix. Chip-screen analyses performed in our lab revealed that L-carnitine has a distinct regulative effect on the transcriptional activity on a significant part of the whole genome (Litzlbauer et. al, 2006). Especially the mRNA expression levels of human carnitine acyltransferase genes CRAT, CPT1A, CPT2 are regulated by L-carnitine (Godárová et al, 2005). We could provide evidence that the murine homologues CRAT, CPT1a, CPT2 and OCTN2 are similarly regulated on transcriptional level by L-carnitine. qPCR analysis of the murine carnitine acetyltransferase (CRAT) gene under supplementation of 80 µM L-carnitine for 4 hours resulted in a 2-fold increase on mRNA level. Reporter gene-assays with constructs carrying different segments of the promoter of the murine CRAT gene localized the “carnitine-effect” regulating element within a 342bp region. Within this region several putative transcription factor bindings sites could be identified with bioinformatical tools. The most promising transcription factor binding sites are SP1, PPARα, RXRα and CREB. Analysis of the retinoic X receptor alpha (RXRα) element with band shift and supershift assays revealed the influence of the transcription factors PPARα, LXRα and PPARbP on CRAT gene regulation under increasing L-carnitine concentration. Additional Southwestern Blot analysis supported the association of these promoter elements to a hypothetical transcription factor complex of the RXR locus. qPCR analysis of CRAT mRNA expression under PPARα-agonist supplementation supports the findings that PPARα is involved in the L-carnitine mediated gene regulation of CRAT. This indicates that CRAT gene-expression is a direct pharmacological target of these hyperlipidemic drugs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
L-carnitine fatty acid metabolism transcriptional control
Schlagwörter
(Deutsch)
L-Carnitine Fettstoffwechsel Transkriptionskontrolle
Autor*innen
Klemens Kienesberger
Haupttitel (Englisch)
L-Carnitine and its transcriptional modulation
Paralleltitel (Deutsch)
L-Carnitine und dessen modulierender Einfluss auf Trankriptionsraten
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
105 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Reinhold Hofbauer
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.89 Endokrinologie
AC Nummer
AC10748280
Utheses ID
16179
Studienkennzahl
UA | 490 | | |