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Control of self-renewal and cell fate in Drosophila neural stem cell lineages
Vivien Rolland
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Juergen Knoblich
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30031.23713.542365-2
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Eine einzige Stammzelle ist in der Lage eine komplette Zelllinie bestehend aus mehreren differenzierten Tochterzellen zu generieren. Um dies zu ermöglichen muss die Stammzelle das Gleichgewicht zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung bewahren. Die Regulierung dieses Gleichgewichts ist sehr komplex und unterliegt einer sehr strengen Kontrolle. Geht dieses Gleichgewicht verloren, können Tumore entstehen. Deswegen ist es wichtig, jene Mechanismen zu verstehen, welchen die komplexe Regulierung dieses Gleichgewichts unterliegt. In dieser Studie untersuchen wir neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten, aus dem larvalen zentralen Nervensystem der Drosophila. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und können sich somit selbst erneuern und gleichzeitig differenzierte Tochterzellen generieren. Es wurde ursprünglich angenommen, dass Neuroblasten sehr „einfache“ Zelllinien generieren, welche aus einer Stammzelle (Neuroblast) und einigen wenigen differenzierten Zellen (Ganglion-Mutterzellen und Neuronen) bestehen. Diese Studie beschreibt einen bisher uncharakterisierten Neuroblastentyp, welcher zunächst intermediäre Vorläufernervenzellen generiert aus denen anschließend die Ganglion-Mutterzellen und Neuronen hervorgehen. Aufgrund dieser Vorläufernervenzellen, welche ebenso wie die Neuroblasten die Fähigkeit besitzen sich selbst zu erneuern, können sehr viel mehr Neuronen in kurzer Zeit generiert werden. Jedoch ist diese Art von Neuroblast genetische instabiler und somit sehr viel sensitiver in Bezug auf die Ausbildung von Tumoren. Bevor sich intermediäre Vorläufernervenzellen teilen und Ganglion-Mutterzellen generiern, durchlaufen sie eine Art Reifeprozess. Dieser Reifeprozess zeichnet sich durch die sukzessive Expression zweier Transkriptionsfaktoren aus. Um die Biologie hinter diesen Vorläufernervenzellen besser zu verstehen, führten wir innerhalb der Neuroblast-Zelllinien eine genomweite Mutantenklassifizierung durch, wobei wir uns hierfür die RNA-Interferenz (RNAi) Bibliothek zu Nutze machten. Es konnten Gene identifiziert werden, welche bei Funktionsverlust zu einer vermehrten Anzahl von Neuroblasten führten. Darunter befand sich ebenfalls das bisher unbekannte Gen CG6049/Barricade (barc). Diese Studie befasst sich mit der Charakterisierung von Barc und zeigt dessen wichtige Bedeutung innerhalb der Neurogenese. Wird Barc mittels RNAi herunter reguliert, verweilen intermediäre Vorläuferzellen in einem unreifen Stadium, anstatt den Reifeprozess vollständig zu durchlaufen, um anschließend Neuronen zu generieren. Somit ist Barc ein neu identifizierter Regulator intermediärer Vorläuferzellen. Barc ist ein Kernprotein, welches zwei RNA Erkennungsmotive und ein Barc/Tat-SF1 Motiv besitzt. Wir zeigen, dass, für die Funktion von Barc innerhalb der intermediären Vorläuferzellen, nur ein RNA Erkennungsmotiv notwendig ist. Ebenso demonstrieren wir in vivo, dass Barc mit der DNS interagiert. Barc ist das homologe Gen des humanen Tat-SF1 und dem CUS2 Gen aus Hefe. Beiden Genen konnte eine Rolle in der transkriptionalen Elongation und des RNA-Spleißmechanismus zugewiesen werden. Um festzustellen ob Barc eine ähnliche Funktion ausübt, etablierten wir ein Zellkultursystem, in welchem wir Barc zunächst effizient ausschalten konnten und anschließend eine Bibliothek von ‚short-capped’ RNAs bzw. mRNAs herstellten. Die nähere Untersuchung dieser Bibliotheken wird uns Aufschluss darüber geben, ob und inwiefern Barc eine Rolle in der Regulierung der transkriptionalen Elongation und/oder des RNA- Spleißmechanismus spielt. Ebenso generierten wir ein mutantes barc Allel und verschiedene transgene Barc-Konstrukte, mittels welcher wir die Funktion von Barc detaillierter analysieren können. Mit Hilfe dieser Konstrukte können wir zum einen untersuchen, ob Barc einen Einfluss auf den Zellzyklus oder das Zellschicksal hat, zum anderen helfen sie uns, um Interaktionspartner von Barc zu identifizieren oder um das Barc-DNA Interaktionsmuster zu entschlüsseln.
Abstract
(Englisch)
Stem cells need to control the balance between proliferation and generation of differentiated cells in order to produce functional lineages. Studying the mechanisms that regulate this equilibrium is particularly relevant since defects in this balance can lead to tumorigenesis. We use the asymmetrically dividing Drosophila larval neuroblasts as a model to study how stem cells self-renew and form specific lineages. Larval neuroblasts of the central brain were thought to form rather simple lineages composed of a single stem cell (neuroblast) and of a few differentiating cells (ganglion mother cells – GMCs – and neurons). Here, we present a previously uncharacterized type of larval neuroblast that produces transit-amplifying cells, called secondary neuroblasts or Intermediate Neural Progenitors (INPs), which then produce GMCs and neurons. Additionally, we show that the lineages formed by these rare neuroblasts are particularly important because they produce a very large amount of neurons and are very sensitive to tumor formation. Before INPs can divide to produce GMCs, they need to mature – a process characterized by the successive expression of two transcription factors. To get a better understanding of INP biology, we made use of a genome-wide RNA interference (RNAi) screen, conducted specifically in Drosophila larval neuroblast lineages. In this screen, several genes led to overproliferation of progenitors upon knock down. Among them was the previously unstudied gene CG6049/barricade (barc). In this study, we characterize barc and show that it is important in neuroblast lineages for the production of neurons. Additionally, we show that upon barc RNAi knock down, most INPs remain in an immature state, demonstrating that Barc is a novel regulator of INPs. Barc is a nuclear protein composed of two RNA recognition motifs (RRMs) and a Barc/Tat-SF1 motif (BTS). Here, we show that only the second RRM of Barc is dispensable for the function of the protein in larval neuroblast lineages. Additionally, we demonstrate that Barc associates with DNA in vivo. Barc is the homologue of human Tat- SF1 and yeast CUS2, two proteins that are involved in transcription elongation and splicing. To test whether Barc acts in a similar way, we established a cell culture system where we can efficiently knock down Barc and from which we prepared libraries of short capped RNAs and mRNAs. Analysis of these libraries will allow us to determine whether Barc acts by regulating transcription elongation and/or splicing. Finally, we generated a mutant allele and several rescue constructs that will enable us to study the effect of barc on cell cycle and cell fate, to identify the binding partners of Barc and to determine its binding pattern on DNA.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
Neuroblast
Autor*innen
Vivien Rolland
Haupttitel (Englisch)
Control of self-renewal and cell fate in Drosophila neural stem cell lineages
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
127 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Maarten van Lohuizen ,
Carrie Cowan
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC09602947
Utheses ID
16770
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1