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Generation and characterization of the postfusion structure of the major surface protein E of tick borne encephalitis virus

Andrea Bernhart

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Karin Stiasny

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DOI

10.25365/thesis.18756

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29987.76184.393753-2

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Flaviviren dringen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in Zellen ein und fusionieren ihre Membran mit der des Endosoms. Fusion wird durch dramatische strukturelle Änderungen des virale Hüllproteins E (“envelope“) vermittelt, die der saure pH des Endosoms induziert. Eine Reorganisation der Oligomere des E Proteins ist die Folge, bei der die Untereinheiten des E Proteins in Monomere dissoziieren und sich aus diesen stabilere Trimere formen. Den bisher bekannten Kristallstrukturen der E Proteine vor und nach der Fusion (Prä- und Post Fusions Struktur) fehlt die so genannte "Stamm" Region (zwischen der Ektodomäne und dem Membran-Anker) und die Transmembranregion. Der Stamm ist vermutlich für die Fusion essentiell. In Fusionsmodellen wird vorgeschlagen, dass während der Dimer-Trimer-Umlagerung der Stamm sich reißverschlussartig am Trimer anlagert (“zippering“) und dass diese Wechselwirkungen für die räumliche Annäherung von der viralen Membran an die Membran der Wirtszelle wesentlich sind. Diese Diplomarbeit konzentrierte sich auf die Herstellung und Charakterisierung von löslichen Formen des E Proteins (sE) in seiner Post Fusions Konformation, die den Stamm oder Teilen davon enthält. Diese Proteine können für weitere Analysen verwendet werden, vor allem für die Bestimmung der dreidimensionalen Strukturen mit Hilfe der Röntgenkristallographie. Die Kenntnis solcher Strukturen kann zu einem besseren Verständnis für die Rolle des Stamms in der Membranfusion führen. Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche sE Proteine des Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME)-Virus in stabil transfizierten Drosophila-Zelllinien exprimiert: TBE sEH1H2, das die gesamte Stamm Region enthält und TBE sEH1, das nur Teile des Stamms enthält. sEH1 wurde mit einem Strep-Tag hergestellt, der auch für die Reinigung des Proteins verwendet wurde. sEH1 wurde überwiegend als Dimeres sezerniert und, nach der Aufreinigung und der Entfernung des Tags, in Gegenwart von Liposomen bei saurem pH trimerisiert. Im Gegensatz dazu lag sEH1H2 bereits als Trimeres im Zellkulturüberstand vor. Aufgrund der erhöhten Hydrophobizität von sEH1H2 im Vergleich zu sEH1 waren Detergenzien für die Aufreinigung erforderlich. Obwohl weitere Optimierungen notwendig sind, um große Mengen an hochreinen sEH1H2 Trimeren zur Kristallisierung herzustellen, erlaubten vorläufige Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern die Identifizierung von wichtigen Wechselwirkungen der Stamm-Region mit anderen Teilen des E Proteins im Post Fusions Trimer.

Abstract

(Englisch)

Flaviviruses enter cells by receptor-mediated endocytosis and fuse their membrane with that of the endosome. Fusion is triggered by the acidic pH of this compartment and mediated by dramatic structural changes of the viral envelope protein E. Exposure to low pH induces an oligomeric rearrangement of E in which the subunits of the native E homodimers dissociate and the monomeric subunits then reassociate into more stable homotrimers. Crystal structures of truncated E proteins in their pre- and postfusion conformation lack the so called ‘stem’ region (located between the ectodomain and the membrane anchor) which is hypothesized to be critically required for fusion. Fusion models predict that during the dimer-trimer-transition the stem „zippers“ along the trimer and that these interactions are essential for bringing the host and viral membrane into close proximity. This diploma thesis focused on the generation and characterization of soluble forms of E (sE) in their postfusion conformation with the stem (or parts thereof) for further analyses including the determination of the three-dimensional structures by X-ray crystallography. Knowledge of such structures would shed novel light on the precise role of the stem for membrane fusion. For this purpose, two different sE proteins of tick-borne encephalitis (TBE) virus were expressed using stably transfected Drosophila cell lines TBE sEH1H2, containing the whole stem region, and TBE sEH1, containing only parts of the stem. sEH1 was expressed with a strep tag which was also used for its purification. This protein was secreted predominantly as a dimer and after purification and removal of the tag the protein was converted into trimers by exposure to low pH in the presence of liposomes. The sEH1H2 protein, in contrast, was already found to be in its trimeric postfusion form in the cell culture supernatant. Due to the increased hydrophobicity of sEH1H2 compared to sEH1, detergents were required for purification experiments. Although further optimization will be necessary to obtain large amounts of highly purified sEH1H2 trimers for crystallization, preliminary studies with monoclonal antibodies were possible and allowed the identification of important interactions of the stem-region with other parts of E in the postfusion trimer.

Autor*innen

Andrea Bernhart

Haupttitel (Englisch)

Generation and characterization of the postfusion structure of the major surface protein E of tick borne encephalitis virus

Paralleltitel (Deutsch)

Herstellung und Charakterisierung der Post-Fusions-Konformation des E Proteins des Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

72 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Karin Stiasny

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10765153

Utheses ID

16810

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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