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The roles of proteases in infection biology
Andreas Alber
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Joachim Seipelt
DOI
10.25365/thesis.2024
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30225.73973.284265-0
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ziel dieser Arbeit war es die Rolle von Proteasen im biologischen Infektionsprozess und die Einflussnahme von PDTC auf diesen Prozess zu untersuchen. PDTC ist ein multifunktioneller Metallchelator. Zwei hauptsächliche Fragestellungen konnten beantwortet werden. Dazu wurden vor allem zwei Methoden gewählt; FACS und Western Blot Analysen.
Zuerst konnte gezeigt werden, dass PDTC nicht im Stande ist die Spaltung von eIF4GI durch die virale Protease 2A zu inhibieren. Für diese Experimente wurde eine HeLa Zelllinie verwendet, welche mit dem HRV2 2A Protease Konstrukt stabil transfiziert war. Die Proteinexpression war unter Kontrolle eines Tetrazyklin indizierbaren Protein Expressionssystem. Es konnte gezeigt werden, dass mit oder ohne Zugabe von PDTC eIF4GI teilweise durch die Protease 2A gespalten wurde. PDTC war nicht im Stande diese Spaltung zu inhibieren.
Als zweites wurde die antiapoptotische Eigenschaft von PDTC in HeLa Zellen untersucht. Auf Basis morphologischer Beobachtungen und Inhibierung von PARP Spaltung und Kaspasen Aktivierung konnte gezeigt werden, dass PDTC eindeutig antiapoptotisch in HeLa Zellen wirkt. Weiters konnte gezeigt werden, dass PDTC auch inhibitorisch auf das Proteasom in dieser Zelllinie wirkt. Um den genauen Wirkungsmechanismus von PDTC zu untersuchen wurden verschiedene Fragestellungen definiert. Es könnte möglich sein, dass oxidativer Stress eine große Rolle während der Apoptose spielt und dass die antioxidative Eigenschaft von PDTC eine Rolle während dessen antiapoptotischen Wirkung spielt. Weiters könnte es möglich sein, dass die inhibitorische Wirkung von PDTC auf das Proteasom eine Rolle während dessen antiapoptotischen Wirkung spielt. Eine letzte große Fragestellung war die Einflussnahme von PDTC auf die Aktivität der BCl-2 Proteinfamilie. Vorhergehende Ergebnisse aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Inhibierung der Apoptose durch PDTC nicht einfach durch die Inhibierung der Kaspasen erklärt werden kann. Vielmehr könnten Proteine der BCl-2 Familie eine entscheidende Rolle dabei spielen. Zusätzlich wurden noch Experimente mit Pyrithion und Hinokitiol durchgeführt, um deren Wirkung zu untersuchen.
Es konnte gezeigt werden, dass die antiapoptotische Wirkung von PDTC weder in Verbindung zu dessen antioxidativen noch zu dessen Proteasom inhibitorischen Wirkung steht. Da die Induktion der Apoptose durch diverse Apoptose induzierende Reagenzien zu keinem generellen oxidativen Stress führte, kann die antioxidative Wirkung von PDTC nicht ausschlaggebend für dessen antiapoptotische Wirkung sein. Experimente mit MG132, ein bekannter Proteasom Inhibitor, haben gezeigt, dass auch diese Eigenschaft von PDTC nicht mit dessen antiapoptotischen Wirkung in Zusammenhang gebracht werden kann.
Weiters konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass PDTC antiapoptotisch wirkt, indem es die Aktivierung der Proteine BAX und BAK inhibiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PDTC ein Inhibitor der Konformationsänderung von BAX und BAK ist, die durch verschiedenste Apoptose induzierenden Reagenzien induziert wird. BAX und BAK, beide Mitglieder der proapoptotischen BCl-2 Proteinfamilie, spielen eine wichtige Rolle während der Apoptose, indem sie Cytochrom C von den Mitochondrien freisetzen. Dieser Prozess wird durch die Konformationsänderung dieser Proteine induziert. In dieser Arbeit war es möglich zu zeigen, dass diese Konformationsänderung durch PDTC inhibiert werden kann und daher der Zelltod verhindert werden kann. Nicht gezeigt werden konnte, ob dies auf einem direkten oder indirekten Weg geschieht.
In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass sowohl extrinsische als auch intrinsische Apoptose induzierende Reagenzien die Kaspasen 8 und 9 aktivieren. Beide sind Mitglieder der Familie der Cystein Proteasen und bekannte Initiator Kaspasen des extrinsischen, bzw. intrinsischen Apoptose Signalweges. Das gibt Grund zur Annahme für eine starke gegenseitige Einflussnahme beider Signalwege. Es konnte auch gezeigt werden, dass die antiapoptotische Wirkung von PDTC in der Regel mit einer starken Reduzierung der Kaspasen Aktivierung einhergeht. Bemerkenswert war, dass PDTC nicht im Stande war die Aktivierung der Kaspase 8 durch extrinsische Faktoren zu inhibieren.
Zuletzt konnte noch gezeigt werden, dass die Metallchelatoren Pyrithion und Hinokitiol eine ähnliche biologische Wirkung wie PDTC besitzen. Dies lässt vermuten, dass Metallionen eine Rolle während dieses Prozesses spielen.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
PDTC Apoptose BAX BAK BCl-2
Autor*innen
Andreas Alber
Haupttitel (Englisch)
The roles of proteases in infection biology
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von Proteasen im Infektionsprozess
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
63 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Joachim Seipelt
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC07135358
Utheses ID
1683
Studienkennzahl
UA | 490 | | |