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Required base complementarity between guide RNAs and target sequences in the CRISPR-Cas-based virus defense mechanism of the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus
Julia Steinkellner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christa Schleper
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.19065
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29700.78763.483159-3
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Mittels CRISPR/Cas-Systemen erwerben Mikroorganismen Immunität gegen Infektion durch Viren und Eindringen anderer exogener Nukleinsäuren. Der CRISPR/Cas Mechanismus beruht auf der spezifischen Erkennung eindringender Fremd-DNA durch kleine, komplementäre RNAs, die als transkribierte Spacer-Sequenzen aus dem CRISPR locus als CRISPR RNAs (crRNAs) hervorgehen und einen so-genannten Protospacer erkennen, d.h. einen Sequenzabschnitt invasiver Nukleinsäuren, welcher Homologie zu einem Spacer aufweist. Im Gegenzug können Viren durch den Erwerb von Mutationen innerhalb ihrer Protospacer-Sequenz einer möglichen DNA Degradation entkommen und somit die erworbene Resistenz ihres Wirtsorganismus umgehen. Bislang wurden die Auswirkungen von Protospacermutationen auf die CRISPR/Cas-basierende Interferenz vor allem in bakteriellen CRISPR/Cas Systemen untersucht. Um mehr über die Anforderungen für die Interaktion zwischen crRNA und Protospacer während der CRISPR/Cas-Interferenz in Archaea zu lernen, wurde der hyperthermophile Crenarchaeote Sulfolobus solfataricus und sein Virus SSV1 als Modellsystem in dieser Studie verwendet. Für die Arbeit wurden verschiedene Protospacermutanten des rekombinanten Virus SSV1 hergestellt und anschließend in mehreren Transfektionsexperimenten untersucht. Die gentechnisch-veränderten Mutanten trugen eine steigende Anzahl an Mutationen an den jeweiligen Enden der Protospacer-Sequenz; d.h. im Ausmaß von sechs bis 18 aufeinander folgenden Mutationen an beiden Protospacerenden. Trotz der eingeführten sechs Mutationen am „down“-Ende des Protospacers, welches dem 3‘-Ende transkribierter Spacer RNA entspricht, vermittelte das S. solfataricus CRISPR/Cas System beinahe 100% Immunität gegen das rekombinante Virus. Im Gegensatz dazu, wurde die Resistenz gegen das rekombinante Virus stark vermindert (um 75%), als sechs Mutationen am anderen Ende („up“-Ende) des Protospacers eingeführt wurden. Es konnten immer noch 50% CRISPR/Cas-basierende Immunität nachgewiesen werden, als 15 aufeinander folgende Mutationen am Protospacer „down“-Ende vorhanden waren. Ähnlich den erst kürzlich angestellten Beobachtungen in E. coli, erwies sich das CRISPR/Cas System als deutlich toleranter gegenüber Mutationen, die am „down“-Ende des Protospacers auftraten. Dies deutet darauf hin, dass CRISPR/Cas-Interferenz in S. solfataricus durch die Erkennung einer kurzen Sequenz am „up“-Ende des Protospacers initiiert wird. Verglichen mit dem bakteriellen System, schien die erforderliche Basenkomplementarität zwischen Zielsequenz und crRNA während der CRISPR/Cas-Interferenz jedoch sehr gering zu sein.
Abstract
(Englisch)
Microbes have evolved various defense strategies in order to prevent viral attack and invasion of foreign DNA, respectively. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (in short: CRISPR) characterize one of those defense mechanisms and are found in many bacterial and most archaeal genomes. CRISPR/Cas systems confer acquired resistance against viruses and plasmids by specifically targeting invasive nucleic acids via sequence complementarity between small spacer-derived CRISPR RNAs (crRNAs) and so called protospacer sequence of the invading (targeted) nucleic acids. Conversely, viruses can find a way to escape CRISPR/Cas resistance by acquisition of mutations within their protospacer sequence. Interestingly, not all protospacer mutations lead to viral escape. So far the impact of protospacer mutations on CRISPR/Cas-mediated interference has mainly been studied in bacterial CRISPR/Cas systems. To learn more about the requirements of crRNA-protospacer interaction during CRISPR/Cas-mediated interference in Archaea, the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus and its virus SSV1 were used as a model system in this study. Various protospacer mutants of the recombinant SSV1 virus were tested in transfection experiments. The engineered mutants carried increasing numbers of mutations at the two different ends of the protospacer sequence, i.e. six up to 18 consecutive mutations at both ends, respectively. The S. solfataricus CRISPR/Cas system conferred almost 100 % immunity against the recombinant virus containing six mutations at the “down”-end of the protospacer, i.e. at the 3’ end with respect to transcription of the spacer RNA. In contrast, viral resistance was severely reduced (by 75 %) when six mutations were introduced at the other end (“up”-end) of the protospacer. Still 50 % viral resistance was observed when 15 mutations were present at the protospacer “down”-end. Similar to observations recently made in E. coli, the CRISPR/Cas system was significantly more tolerant towards mutations present at the “down”-end of the protospacer than at the other end, suggesting that CRISPR/Cas interference in S. solfataricus might be initiated by the recognition of a short sequence at the “up”-end of the protospacer. In contrast to the bacterial system however, the required base complementarity between the target sequence and crRNA during CRISPR/Cas interference seemed to be very low.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
CRISPR-Cas-based DNA interference model system Sulfolobus solfataricus-SSV1 Protospacer mutants increasing protospacer mutations transfection experiments calculation of PFU's
Schlagwörter
(Deutsch)
CRISPR-Cas-basierende DNA Interferenz Modellsystem Sulfolobus solfataricus-SSV1 Protospacer-Mutanten Steigende Protospacer-Mutationsanzahl Transfektionsexperimente Auswertung PFU's
Autor*innen
Julia Steinkellner
Haupttitel (Englisch)
Required base complementarity between guide RNAs and target sequences in the CRISPR-Cas-based virus defense mechanism of the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus
Paralleltitel (Deutsch)
Erforderliche Basenkomplementarität zwischen guide RNAs und Zielsequenzen im CRISPR/Cas-basierten Virus Abwehrmechanismus des hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
68 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christa Schleper
Klassifikationen
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC09022789
Utheses ID
17081
Studienkennzahl
UA | 444 | | |
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