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Phylogenie, Morphologie und Lipide von Algen der Gruppe Trebouxiophyceae
Markus Gruber
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Michael Schagerl
DOI
10.25365/thesis.19351
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29984.93994.484862-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Grünalgen spielen eine wichtige Rolle als Primärproduzenten in aquatischen
Nahrungsnetzen und dienen als Ernährungsgrundlage für viele Zooplankter. Botryococcus
braunii ist eine koloniale Grünalge, die in eine heterogene Gruppe innerhalb der
Grünalgen, der Trebouxiophyceae, fällt. Heterogen deshalb, weil diese Gruppe sowohl
aquatische als auch terrestrische Algen beinhaltet. B. braunii fiel ins Auge von
Biotechnologen, da sie bis zu 86% des Trockengewichtes in Lipide zu synthetisieren
vermag. Das besondere an den Lipiden, die von B. braunii synthetisiert werden ist, dass
es sich hierbei vor allem um langkettige Kohlenwasserstoffe handelt, und dass diese mehr
oder weniger in die aquatische Umgebung entlassen was eine Extraktion einfach
erscheinen lässt. Aufgrund der verschiedenen Kettenlängen der produzierten
Kohlenwasserstoffe, wurde das Taxon in so genannte Rassen (=Chemotypen) gegliedert.
In dieser integrativen Studie wurden Algen dieser Art aus Gewässern in Oberösterreich
und Wien isoliert, kultiviert und dann aufgrund molekularer Phylogenie, Morphologie und
Kohlenwasserstoff-Rassen untersucht. Die molekulare Phylogenie wurde mit Polymerase
Kettenreaktion, die Morphologie mit Lichtmikroskopie und die Kohlenwasserstoffe mit
Gaschromatographie und Massenspektrometrie untersucht. Zusätzlich wurden Lipide mit
dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nil Rot gefärbt und anschließend mit Konfokaler
Laser-Scanning Mikroskopie im Kontrast zur Autofluoreszenz der Chloroplasten dargestellt
um zu erkennen, wo die Lipide synthetisiert werden. Mit Mantel-Tests wurden Matrizen aus
den unterschiedlichen Datensätzen miteinander verbunden und verglichen. Unsere
Analysen stehen im Kontrast zu bereits bestehenden Analysen anderer B. braunii-
Stämme, da in unseren Isolaten keine Korrelation der molekularen Phylogenie mit dem
Kohlenwasserstoff-Rassen erkenntlich war. Interessanterweise stimmten aber einige
morphologische Parameter mit jenen der ITS-2 Sequenzen signifikant überein, u. a. das
Längen-zu-Breiten Verhältnis der Zellen. In Anbetracht, dass die Besammlungsstellen der
B. braunii-Isolate teilweise nur wenige Meter voneinander entfernt waren, war die
genetische Variabilität basierend auf SSU und ITS-2 größer als angenommen. Analysen
weiterer Isolate könnten Aufschluss über die schwierige Artabgrenzung innerhalb der
Gattung Botryococcus geben.
Da B. braunii, wahrscheinlich aufgrund seiner Lipidassimilation, nur langsam wächst,
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haben wir in einer zweiten Studie acht Stämme (aus den Algenkultursammlungen CAUP
und SAG) der Gattung Choricystis, welche nahe verwandt ist zu B. braunii, gezüchtet und
auf eine mögliche Nutzung für industrielle Zwecke untersucht. Diese Stämme wurden auf
Wachstumsraten, molekulare Phylogenie, Morphologie und Fettsäure-Profile untersucht. In
einem Ansatz wurden die Algen in dynamischen Belüftungskulturen gezüchtet und auf
Wachstum und Fettsäure-Profile analysiert; in einem zweiten Ansatz wurden zwei SAGStämme
in statischen, unbelüfteten Kulturen angesetzt und das Wachstum und Fettsäure-
Profil mit den belüfteten verglichen. Die molekularbiologischen und morphologischen
Analysen ergaben, dass die CAUP-Stämme nicht zur Gattung Choricystis, aber zu den
Gattungen Nannochloris und Coccomyxa, zwei weiteren Gattungen innerhalb der
Trebouxiophyceae, gehören. Zellverdopplungszeiten waren vergleichbar; die Stämme
CAUP H5102 und H5104 hatten im Mittel schnellere Zellverdoppelungszeiten (0.68 und
0.44). Im phylogenetischen Stammbaum zeigten die beiden Nannochloris-Stämme eine
enge Verwandtschaft zu der Gattung Catena und unterstreichen die Möglichkeit, dass die
Gattung Nannochloris polyphyletisch ist und daher aufgeteilt werden sollte. Probleme bei
der Artabgrenzung der Gattungen Choricystis und Nannochloris waren bereits vorher
bekannt. Die Fettsäure-Profile der Belüftungskulturen zeigten semi-quantitative
Unterschiede, v. a. in der Produktion von den gesättigten Fettsäuren Palmitinsäure (C:16)
und Stearinsäure (C:18) und den ungesättigten C16 und C18-Fettsäuren (C16:1, C18:2
und C18:3). Eklatant verschieden waren die Fettsäureprofile der beiden Nannochloris-
Stämme. In CAUP H5102 konnten (>50%) von C18:3 nachgewiesen werden wobei in
CAUP H5104 hauptsächlich Palmitinsäure gefunden wurde (>70%). Im Vergleich zu den
Belüftungskulturen, war in den unbelüfteten, echten Choricystis-Kulturen der SAG auch
Docosansäure (C22:0) zu finden, was ein Novum in diesen Algenarten darstellt und
eventuell auf die Extraktionsmethode rückzuführen ist; ungesättigte Docosapentaensäure
(C22:5) oder Docosahexaensäuren (C22:6) wurden bereits früher in Choricystis
nachgewiesen. Vor allem der Stamm CAUP H5104 scheint aufgrund des hohen Anteils
von C18:3 für die Produktion von Nahrungsergänzungsmittel geeignet zu sein; CAUP
H5102 aufgrund der hohen C18:0 Werte für die Biodiesel-Produktion (>20%). Allerdings
darf man nicht außer Acht lassen, dass sich das Fettsäureprofil durch unterschiedliche
Wachstumsbedingungen ruckartig ändern kann.
Abstract
(Englisch)
Green algae are important primary producers in aquatic food webs and serve as basic
nutrition for several higher trophic levels such as zooplankton. Botryococcus braunii is a
colonial coccal green algae, that belongs to a rather heterogeneous clade within the green
lineage, the Trebouxiophyceae. In that case, heterogenous means that this group not only
consists of aquatic but also of terrestric algae. Due to the fact that B. braunii produces high
amounts of lipids (up to 86% dw-1), biotechnologists have focused on this taxon since the
late 60ies. The special feature of the synthesized lipids are that they mainly consist of
long-chained hydrocarbons and that they are released into the aquatic environment.
Therefore, extraction of the hydrocarbons seems easy. B. braunii was classified earlier into
so called „races“ (=chemotypes) according to types and lengths of these hydrocarbons. In
this integrative study, this alga was isolated from several aquatic waterbodies in Upper
Austria and the vicinity of Vienna, cultivated and investigated in terms of molecular
phylogeny, morphology and hydrocarbon-races. Molecular phylogeny was investigated
with polymerase chain reaction (PCR), morphology with light microscopy and
hydrocarbons with gas chromatography and mass spectrometry. Furthermore, lipids were
stained with the lipophilic fluorescence dye Nile Red and in addition with the
autofluorescence of the chloroplasts depicted with confocal laser scanning microscopy
(CLSM) to identify the location of lipid-synthesis. For each dataset, several matrices were
established and compared with Mantel-tests. Our analyses partially are in contrast to
previous studies that proposed congruency of the “races“ with phylogeny as we could not
observe that pattern. However, some morphological parameters showed significant
correlation between morphological traits such as the length:width ratio and mucilage
stratification with the ITS-2 sequences. Although several isolation sites were only a stone’s
throw away from each other, a comparatively high genetic variation based on the SSU was
detected. The analysis of additional isolates would be needed to resolve the species
delineation within the Botryococcus clade.
Most likely because of the high lipid assimilation, B. braunii is growing only very slowly.
Therefore, in a second study eight strains derived from two culture collections (SAG and
CAUP) designated as Choricystis, a closely related genus of B. braunii, were investigated
in order to estimate the potential for industrial purposes. These strains were grown in
dynamic airlift cultures and analyzed in terms of molecular phylogeny, morphology and
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fatty acid profiles. In another approach, two SAG-strains were grown in static unaerated
conditions and compared with the dynamically grown strains. The molecular biological
analyses revealed that the strains derived from CAUP belonged to other genera within the
Trebouxiophyceae, namely Nannochloris and Coccomyxa. Doubling times revealed that
dynamic cultures were growing ten times faster than static ones. Among the dynamic
cultures especially CAUP H5102 and CAUP H5104, both identified as Nannochloris sp.,
were growing the fastest (td = 0.68 and 0.44). The phylogenetic tree proposed a close
relation of the latter with genus Catena and underlines the polyphyly of this “genus“.
Problems concerning the species delineation between Choricystis and Nannochloris were
mentioned in previous studies. Fatty acid profiles of dynamic cultures showed semiquantitative
differences, especially in the detection of saturated acids such as palmitic acid
(C16:0) and stearic acid (C18:0); further among unsaturated fatty acids such as C16:1,
C18:2 and C18:3. Significant differences were detected between the fatty acid profiles of
the two Nannochloris strains. In CAUP H5102 more than 50% of identified fatty acids were
detected from C18:3 whereas in CAUP 5104 more than 70% of palmitic acid. In contrast to
the fatty acid profiles of the dynamic SAG-cultures, within the static cultures, docosanoic
acid (C22:0) was found, which was never detected in this genus earlier and could be due
to extraction method as docosapenatnoic acid (C22:5) and docosahexanoic acid (C22:6)
were detected earlier. Concerning industrial usability, especially CAUP H5102 seems,
because of the relatively high amounts of C18:3, to be a promising strain for production of
nutrient supplementary. Further, CAUP H5102 could be interesting for biodiesel production
as 20% of stearic acid were detected and that fatty acid is an interesting fatty acid for
industrial biodiesel production.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Biotechnology Botryococcus braunii Coccomyxa, Nannochloris PUFA fatty acids hydrocarbons molecular phylogeny ITS-2 secondary structures
Schlagwörter
(Deutsch)
Biotechnologie Botryococcus braunii Coccomyxa Nannochloris PUFA Fettsäuren Kohlenwasserstoffe ITS-2 Sekundärstruktur
Autor*innen
Markus Gruber
Haupttitel (Deutsch)
Phylogenie, Morphologie und Lipide von Algen der Gruppe Trebouxiophyceae
Paralleltitel (Englisch)
Phylogeny, morphology and lipids from trebouxiophycean green algae
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
105 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Michael Schagerl
Klassifikationen
35 Chemie > 35.07 Chemisches Labor, chemische Methoden ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.17 Allgemeine Physiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,
42 Biologie > 42.35 Protistologie ,
42 Biologie > 42.50 Phycophyta ,
43 Umweltforschung > 43.33 Umweltfreundliche Nutzung natürlicher Ressourcen
AC Nummer
AC09022836
Utheses ID
17324
Studienkennzahl
UA | 444 | | |