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Quantification of Vibrio cholerae in Lake Neusiedler See by means of classical and molecular biological methods

Birgit Karin Steinberger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*innen

Angela Witte ,

Alexander Kirschner

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DOI

10.25365/thesis.2099

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30123.38300.274670-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Vibrio cholerae ist ein bewegliches, Gram-negatives, heterotrophes Stäbchen, das zur Familie der Vibrionaceae gehört. Neben seiner Rolle als wichtiger pathogener Mikroorganismus, ist es auch Bestandteil der normalen Bakterienflora der aquatischen Umwelt, welche Süß-, Brack- und Salzwasser umschließt. Zusätzlich weist es eine duale Lebensform auf, welche entweder Partikel/Zooplankton assoziiert oder frei lebend (planktonisch) sein kann. Von den 200 momentan bekannten V. cholerae Serogruppen können nur Stämme, die zu den Serogruppen O1 und O139 gehören, Cholera, eine schwere Durchfallerkrankung, auslösen. NonO1/nonO139 V. cholerae sind für weniger schwere Durchfallerkrankungen und Blut-, Wund-, Ohr- und Atemwegsinfektionen verantwortlich. Zwischen 2000 und 2007 hat die Weltgesundheitsorganisation über 249 importierten O1/O139 V. cholerae Fällen, in 14 unterschiedlichen europäischen Ländern, berichtet. Im Zeitraum von 2000 bis 2005 traten 14 Infektionen, die auf nonO1/nonO139 V. Cholerae zurückzuführen sind, in Österreich auf. Fünf dieser Infektionen, welche auch einen Todesfall inkludieren, konnten direkt mit dem Neusiedler See in Verbindung gebracht werden. V. cholerae wird üblicherweise in der Umwelt mittels Kultivierung auf Selektivmedium detektiert. Es ist allgemein bekannt, dass V. cholerae unter gewissen Bedingungen, wie Nährstoffmangel und niedriger Temperatur, in den sogenannten VBNC Status (viable but non culturable) wechseln kann, innerhalb dessen es nicht mehr mittels Kultivierungsmethoden detektierbar ist. In dieser Diplomarbeit wurde V. cholerae im Neusiedler See mittels kultivierungsbasierten und molekular biologischen Methoden (Fluoreszenz In Situ Hybridisierung = FISH) an zwei Probenpunkten (Seemitte und Schilfgürtel) quantifiziert. V. cholerae wurde in drei unterschiedlichen Größenfraktionen (> 12 μm, 3-12 μm und 0,2-3 μm) sowie auf Zooplankton (Copepoda Arctodiaptomus spinosus und Cladocera Diaphanosoma mongolianum) von Februar bis August 2008 detektiert. Dafür wurde ein spezifisches FISH Protokoll für dessen Detektion in Umweltproben entwickelt. Mittels Verknüpfung seiner Konzentration mit einer Vielzahl von Umweltparametern, wurde versucht die bevorzugte Nische von diesem Pathogenen im Neusiedler See aufzufinden. Die Ergebnisse zeigen, dass das ausgewählte FISH Protokoll zur Detektion von Bakterien im Labor und im Freiland geeignet ist, sogar wenn sich die Bakterien im VBNC Status befinden (Februar bis Mitte Mai). Ein großer Nachteil der etablierten FISH Methode war, dass die Gegenwart von hohen Partikelkonzentrationen in der Wassersäule zu Zeiten hoher Windgeschwindigkeit (hauptsächlich in der Seemitte), die Genauigkeit und die Zuverlässigkeit der Methode limitierte, was weiter dazu führte, dass die mögliche Beziehung zwischen V. cholerae Konzentrationen und Umweltvariablen maskiert wurde. Beide, FISH und Kultivierung wiesen die höchsten Zellzahlen im Juli, mit 22.000 – 26.000 CFU L-1 und 45.000 - 46.000 CFU L-1, und abnehmenden Werten an den zwei folgenden Probenpunkten auf, was auf einen Abfall von Partikeln in der Wassersäule, aufgrund milder Wetterbedingungen, zurückzuführen ist. Von Mai bis August wurde mit beiden Methoden ähnliche Resultate erreicht und es gab eine signifikant positive Korrelation zwischen FISH und kultivierungsbasierten V. cholerae Konzentrationen. Es traten signifikant höhere V. cholerae Konzentrationen in der Seemitte als im Schilfgürtel auf. In beiden, der Seemitte und dem Schilfgürtel, wurden mittels Kultivierung die meisten Bakterien in der Größenfraktion 3- 12 μm detektiert, was darauf hinweist, dass diese Partikelfraktion bestimmte Umweltbedingungen aufweist, welche die Kultivierung von V. cholerae verstärkt. Im Gegensatz dazu, traten mittels FISH die meisten Bakterien in der Größenfraktion 0,2-3 μm auf. Da es sich herausgestellt hat, dass die Zuverlässigkeit und Ausbeute an Zellen mittels FISH von der Partikelkonzentration im Wasser abhängt und die Fraktion 0,2-3 μm die partikelärmste Fraktion war, könnte dieses Ergebnis möglicherweise auf eine methodische Verzerrung zurückzuführen sein. Im Gegensatz zum allgemeinen Wissensstand, zeigten die nonO1/nonO139 isolierten V. cholerae Stämme aus dem Neusiedler See eine sehr schwache Assoziation mit Copepoden, aber eine sehr starke Verknüpfung mit der dominierenden Cladoceren Art. Das impliziert, dass es eine spezifische Interaktion zwischen bestimmten Zooplankton Arten und V. cholerae Arten geben muss. Außerdem zeigt der große Unterschied an Cladoceren assoziierten V. cholerae Konzentrationen zwischen der FISH und kultivierungsbasierten Methode, dass die meisten Zooplankton angehefteten Bakterien die inneren Oberflächen kolonisieren und nicht auf dem Exoskelett vorkommen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass V. cholerae Stämme im Neusiedler See einige Überlebensstrategien (Anheftung an Cladoceren, Assoziation mit der 3-12 μm Partikelfraktion, planktonisches Wachstum) zu haben scheinen und anscheinend nicht nur eine, spezialisierte ökologische Nische besetzten.

Abstract

(Englisch)

Vibrio cholerae is a motile, Gram-negative, heterotrophic rod that belongs to the family Vibrionaceae. Besides being an important human pathogen, it is a component of the normal bacterial flora of aquatic environments, including fresh, brackish and sea water. In the environment, at least two modes of life have been discussed, either particle/zooplankton associated or free living (planktonic). Of the 200 currently recognized serogroups of V. cholerae, only strains belonging to serogroups O1 and O139 can cause cholerae, a fatal diarrhoeal disease. NonO1/nonO139 V. cholerae strains are responsible for less severe watery diarrhoe and infections of blood, wound, ear and the respiratory tract. Between 2000 and 2007, the World Health Organization (WHO) reported of 249 imported O1/O139 V. cholerae cases in 14 different European countries. During the period from 2000 to 2005, 13 infections due to environmental nonO1/nonO139 V. cholerae strains were documented in Austria. Five infections thereof could be directly related to Lake Neusiedler See, including one case of death. Vibrio cholerae is usually detected from environmental samples by means of cultivation on selective media. However, under certain circumstances, like nutrient deprivation and low temperature V. cholerae changes to the so-called VBNC status (viable but non cultivable) where it is undetectable by cultivation. In this study, environmental V. cholerae from the lake Neusiedler See were quantified by a cultivation based and a molecular biological method (fluorescence in situ hybridisation = FISH) at two different sampling sites (lake center and reed belt). V.cholerae were detected in three different size fractions (> 12 µm, 3-12 µm and 0.2-3 µm) as well as on zooplankton (copepods Arctodiaptomus spinosus and the cladocerans Diaphanosoma mongolianum) from February till August, 2008. Therefore a specific FISH protocol was developed for its detection in environmental samples. By relating its abundance to a variety of environmental parameters it was attempted to trace the preferred ecological niche of this human pathogen in the Lake Neusiedler See. The results indicate that the selected FISH protocol was suitable for detection of the bacteria in laboratory experiments and environmental samples even when the cells were in the VBNC status (February to mid May). However, one major disadvantage of the established FISH protocol was that the presence of high particle concentrations in the water column at periods of high wind speed (mainly in the lake center) limited the accuracy and reliability of the method which further led to a masking of possible relationships of V. cholerae concentrations to environmental variables. Both, FISH and cultivation showed cell number peaks in July with 22.000 - 26.000 CFU L-1 and 45.000 - 46.000 CFU L-1, and decreasing values on the two following sampling dates, which could be attributed to a decrease in particles in the water column due to calm weather situations. From May to August, both methods yielded similar results and there was a significant positive correlation between the FISH and cultivation based V. cholerae concentrations. Significantly higher V. cholerae concentrations were present in the lake center than in the reed belt. In both, the lake center and the reed belt most of the cells could be detected in the size fraction 3-12 μm by cultivation indicating that this particle fraction contains certain environmental features that enhance V. cholerae cultivability. In contrast, by means of FISH most V. cholerae cells occurred in the size fraction 0.2-3 μm. Because the reliability and recovery of cells by the FISH method proved to be dependent on the particle concentration in the water and the 0.2-3 μm size fraction was the poorest in particles this may be due to a methodical bias. Surprisingly, in contrast to common knowledge, the nonO1/nonO139 V. cholerae strains isolated from the lake Neusiedler See showed very weak association with copepods but a strong association with the dominant cladocerans species. This implicates that there is a specific interaction between certain zooplankton species and specific V. cholerae strains. Moreover, the large difference in cladoceran associated V. cholerae numbers between the FISH method and the cultivation based approach indicates that most of the zooplankton attached cells colonize inner surfaces and are not present on the exoskeleton. Summing up, the V. cholerae strains in Lake Neusiedler See seem to have several life strategies (attachment to cladocerans, association with the 3 – 12 µm particle fraction, planktonic growth) and do not occupy a single specialized ecological niche.

Autor*innen

Birgit Karin Steinberger

Haupttitel (Englisch)

Quantification of Vibrio cholerae in Lake Neusiedler See by means of classical and molecular biological methods

Paralleltitel (Deutsch)

Quantifizierung von Vibrio cholerae im Neusiedler See mittels klassischer und molekular biologischen Methoden

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

57 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Angela Witte

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,

42 Biologie > 42.90 Ökologie: Allgemeines

AC Nummer

AC07653290

Utheses ID

1754

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter