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Studies on the functions of calpain as a plectin isoform 1a-degrading protease involved in keratinocyte differentiation and Epidermolysis Bullosa Simplex Ogna

Sabrina Maria Ingrid Sibitz

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Gerhard Wiche

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DOI

10.25365/thesis.20148

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30456.47355.607861-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Plectin ist ein ungewöhnlich großes (500 kDa) und vielseitiges cytoskelettäres Vernetzungsprotein. Es interagiert mit einer Vielzahl von Zytoskelettkomponen-ten, unter anderem Aktin Filamenten, Mikrotubuli und Intermediärfilamenten. Plectin kommt in unterschiedlichen Isoformen vor. Die in der Epidermis expre-mierte Isoform 1a (P1a) bildet gemeinsam mit Integrin β4 (ITGβ4) Hemidesmo-somen (HD) aus. HD sind trans-membranöse Adhesionskomplexe, welche die basalen Keratinozyten der Epidermis an der darunterliegenden Basallamina ver-ankern und so der Haut Stabilität verleihen. Eine autosomal-dominante Mutation einer einzelnen Base im Plectin Gen verursacht die Hautkrankheit Epidermolysis Bullosa Simplex-Ogna (EBS-Ogna). In der Epidermis von EBS-Ogna Modell-mäusen sind die Proteinniveaus von P1a, sowie die entsprechende Anzahl von HDen stark reduziert. Calpaine sind weit verbreitete Cystein Proteasen welche unter anderm ITGβ4 proteolytisch abbauen können. Der proteolytische Abbau von HD-Proteinen könnte einen essenziellen Schritt im Zuge der terminalen Differen-zierung von Keratinozyten darstellen. Weiters besteht die Möglichkeit, dass die gezielte Proteolyse von HD-Proteinen zum Pathomechanimsus von EBS-Ogna beiträgt. Im Zuge dieser Diplomarbeit wurde daher die Rolle von Calpainen in der Pathogenese von EBS-Ogna, sowie der terminalen Differenzierung von Keratino-zyten untersucht. Mithilfe einer enzymatischen in vitro Messmethode konnte ich die Aktivität von Calpainen in immortalisierten Mauskeratinozyten nachweisen. Weiters konnte ich mittels subzellulärer Fraktionierung zeigen, dass Calpaine sowohl an der Plasma-membran lokalisiert als auch mit dem Cytoskellett assoziiert sind. Aktivierung von Calpainen in immortalisierten Keratinozyten zeigte, dass Calpaine P1a und ITGβ4 abbauen können, und dass sich dieser Abbau durch Inaktivierung von Calpainen mittels spezifischer Peptid-Inhibitoren verhindern ließ. In terminal diffe-renzierenden primären Mauskeratinozyten erhöhte die Inhibierung von Calpainen die Proportion an inaktiven Calpainen und gab somit Hinweise darauf, dass Cal-paine auch im Zuge der terminalen Differenzierung aktiv sind. Mithilfe einer EBS-Ogna Mauslinie konnte ich des Weiteren die Beteiligung von Calpainen im Zuge der Pathogenese von EBS-Ogna zeigen. In primären Keratinozyten von EBS-Ogna Mäusen führte die Inhibierung von Calpainen zu einer Erhöhung der P1a Proteinspiegel und Anzahl an HD-Proteinen angereicherten Komplexen. Zu-sätzlich wurde eine klonale Zelllinie von Keratinozyten etabliert, welche die EBS-Ogna Mutation heterozygot exprimieren (Plecwt/Ogna). Im Zuge der Etablierung zeigten die Plecwt/Ogna Klone ein langsameres Wachstum verglichen mit den Zellen des Wildtyps. Diese Beobachtung könnte eventuell einen Hinweis auf eine bisher nicht beschriebene Funktion von HDen (und HPCs) als Zellproliferationregulatoren liefern.

Abstract

(Englisch)

Plectin is a large (~500 kDa) and versatile member of a family of proteins called plakins or cytolinkers. It is able to interact with a multitude of cytoskeletal pro-teins including components of all major cytoskeletal filament systems of the cy-toskeleton, and is spliced into various isoforms. Plectin isoform 1a (P1a), which is predominantly expressed in skin, is an essential component of hemidesmosomes (HDs) where it binds to integrin β4 (ITGβ4). HDs are transmembrane adhesion complexes, which anchor basal keratinocytes of the epidermis to the underlying basal lamina, thus conferring mechanical stability to the skin. A single autosomal dominant missense mutation in the plectin gene causes the skin blistering disease Epidermolysis Bullosa Simplex-Ogna (EBS-Ogna), which manifests with dra-matically diminished P1a protein levels and reduced numbers of HDs. Calpains, cysteine proteases expressed in several tissues including the epidermis, have been demonstrated to degrade ITGβ4. Proteolytic degradation of HD components could be an important prerequisite for terminal differentiation of keratinocytes and could also be involved in the pathomechanism underlying EBS-Ogna. For these reasons, I assessed the role of calpains as possible candidates for P1a proteolysis at the onset of terminal differentiation and in the pathogenesis of EBS-Ogna. Performing an enzymatic activity assay, I could demonstrate that calpains are ac-tive in immortalized mouse keratinocytes. I also found that in immortalized mouse keratinocytes a fraction of calpains is localized at the plasma membrane and asso-ciated with the cytoskeleton. Furthermore, hyperactivation of calpains in immorta-lized mouse keratinocytes led to P1a and ITGβ4 degradation, which could be blocked by treatment with a cell permeable peptide inhibitor of calpains. Results with the analysis of primary mouse keratinocytes undergoing differentiation sug-gested that a fraction of calpains must be active during terminal differentiation since treatment of the cells with a pharmacological inhibitor of cysteine proteases increased the protein levels of the inactive full length form of calpains. Further-more, using a mouse model mimicking EBS-Ogna I found that calpains are in-volved in the proteolysis of P1a in primary keratinocytes derived from mutant animals. Upon inhibition of calpains in primary EBS-Ogna keratinocytes, elevated P1a protein levels could be detected along with increased numbers of HD-like protein complexes (HPCs). Finally, I established clonal keratinocyte cell lines carrying the heterozygous EBS-Ogna mutation (Plecwt/Ogna). Compared to wild-type clones, Plecwt/Ogna keratinocytes showed signs of proliferation defects pointing towards a hitherto undetected role of HDs as regulators of cell proliferation.

Autor*innen

Sabrina Maria Ingrid Sibitz

Haupttitel (Englisch)

Studies on the functions of calpain as a plectin isoform 1a-degrading protease involved in keratinocyte differentiation and Epidermolysis Bullosa Simplex Ogna

Paralleltitel (Deutsch)

Studien zur Funktion von Calpainen als Plectin Isoform 1a-abbauende Proteasen im Zuge der Differenzierung von Keratinozyten und Epidermolysis Bullosa Simplex Ogna

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

94 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Gerhard Wiche

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10860581

Utheses ID

18022

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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