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Biochemical and physiological investigations on the energy metabolism of ammonia oxidizing archaea

Christine Elisabeth Bauer

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Christa Schleper

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DOI

10.25365/thesis.20332

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29512.38061.459163-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Seit der Entdeckung Ammoniak oxidierender Archaea (AOA) im Jahr 2005 wird ihr Beitrag zum globalen Stickstoffkreislauf diskutiert. Zur besseren Charakterisierung müssen jedoch mehr Erkenntnisse über ihren noch weitgehend unbekannten Energie und Kohlenstoffmetabolismus gewonnen werden. In dieser Arbeit wurde die archaeale Ammoniakoxidation untersucht, mit Fokus auf den zweiten Teilschritt und ein potenziell darin involviertes Enzym sowie mögliche (Zwischen-) Produkte. In Ammoniak oxidierenden Bakterien (AOB) wird im ersten Schritt dieses Prozesses mittels des Enzyms Ammoniummonooxigenase (AMO) Ammonium zu Hydroxylamin oxidiert und im zweiten Schritt wird dieses mittels der Hydroxylaminoxidoreduktase (HAO) weiter oxidiert zu Nitrit. In Archaea finden sich zwar AMO-Homologe, jedoch sind weder das Zwischenprodukt, noch das/die Enzym(e), die den zweiten Schritt katalysieren, bekannt. Das hier untersuchte Enzym ist ein Multicopperprotein der AOA, welches Homologie zu Nitritreduktasen (NirKs) aufweist. Aufgrund seiner starken Transkription unter aeroben Bedingungen und der Tatsache, dass Enzyme oftmals ihre Reaktion in beide Richtungen katalysieren können, wurde die Hypothese aufgestellt, dass dieses Enzym ein Zwischenprodukt der Ammoniakoxidation (möglicherweise NO) zu Nitrit oxidieren könnte. Neben biochemischen Experimenten mit diesem Protein wurden auch Versuche mit Rohextrakten und Kulturen von Ca. Nitrososphaera viennensis durchgeführt, um Hinweise auf mögliche Aktivitäten und Zwischenprodukte in der archaealen Ammoniakoxidation zu erhalten. Die in Escherichia coli heterolog exprimierte NirK zeigte keine Nitritreduktaseaktivität. In Gegenwart eines künstlichen Elektronenakzeptors wurde Hydroxylamin oxidiert, jedoch wurde unter keinen der getesteten Bedingungen nachweisbares Nitrit freigesetzt (partielle HAO-Aktivität). Die Ergebnisse bezüglich andersartiger Stickstoff-Produkte (NO, N2O) waren nicht eindeutig. Der berechnete KM Wert für diese Reaktion von 0,5–1,3 mM zeigte keine hohe Affinität des Enzyms für Hydroxylamin. Da die Reduktion des Elektronenakzeptors auch mit Kupfer(II)-chlorid-dihydrat Lösungen erfolgte, konnte die Enzymspezifität dieser Reaktion weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Es gab keine Anzeichen dafür, dass die NirK andere Stickstoff-Substrate (NO, HNO, NH4+) oxidiert. Da das untersuchte Enzym von einer Metagenom-Bibliothek (Contig 54d9) stammte und es für weitere Studien von Vorteil wäre, die NirK von Ca. N. viennensis zur Verfügung zu haben, wurde ihre Expression in E. coli angestrebt. Das Gen wurde in den Expressionsvektor pET28a ligiert, doch nach der Sequenzierung der Klone stellte sich heraus, dass die amplifizierte DNA von dem ebenfalls im Labor verfügbaren Schwesternstamm EN123 stammte. Zusätzlich wurde versucht, die NirK in verschiedenen Proteinfraktionen von Ca. N. viennensis nachzuweisen, um festzustellen ob die in Transkriptomstudien gefundene Expression auch im Proteom nachvollziehbar ist. Jedoch konnte keines der durch MALDI-TOF identifizierten Peptide der gesuchten Nitritreduktase zugeordnet werden. Um biochemische Experimente mit Rohextrakten durchführen zu können, musste aufgrund des langsamen Wachstums und der geringen Zelldichte von Ca. N. viennensis die Ausbeute an Zellen mittels Vergrößerung der Kultur auf mehrere Liter erhöht werden. Der Prozess der Ammoniumoxidation war im Zellextrakt nicht nachweisbar. HAO Aktivität wurde nur indirekt durch die Reduktion des Elektronenakzeptors festgestellt, jedoch abermals ohne die Bildung von Nitrit. Weiters wurden keine Hinweise auf NO Aktivität gefunden. Interessanterweise konnte sowohl im Zellextrakt als auch in der löslichen und unlöslichen Fraktion des Zellextrakts Nitritreduktaseaktivtät nachgewiesen werden. Dies ist ein Indiz für die Relevanz dieser Reaktion in dem Organismus. Ob diese Aktivität auf die NirK zurückzuführen ist, bleibt noch ungeklärt. Ein weiteres Experiment um Indizien für NO als mögliches Zwischenprodukt in der archaealen Ammoniumoxidation zu erhalten, war die Kultivierung von Ca. N. viennensis in Gegenwart eines spezifischen NO-Fängers (PTIO, Abkürzung für 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolineoxyl-1-oxyl-3-oxide). Nitrosospira multiformis (AOB) und E. coli Kulturen fungierten als Kontrollen. In vergleichbaren Konzentrationen wurde das Wachstum von Ca. N. viennensis am stärksten von PTIO inhibiert. Somit könnte NO ein wichtiges (Zwischen-) Produkt in der Ammoniumoxidation sein. Weiters deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Mechanismus der Ammoniumoxidation oder zumindest der enzymatische Apparat der AOAs anders ist als der von AOB. In dieser Studie konnte die physiologisch relevante Aktivität des NirK Homologs nicht eindeutig bestimmt werden. In Zellextrakten wurde jedoch Nitritreduktaseaktivität nachgewiesen. Als mögliches (Zwischen-)Produkt wurden nur Hinweise auf NO gefunden. Aufgrund der Komplexität des Prozesses scheint es nicht einfach, die Ammoniumoxidation in vitro nachzuvollziehen. Komplexe Elektronentransferprozesse, eine Vielzahl von involvierten Enzymen und reaktive N-Spezies erschweren ihre Aufklärung. Weitere biochemische Verfahren müssen hinzugezogen werden, um diesen Mechanismus aufzuklären.

Abstract

(Englisch)

Since the discovery of ammonia oxidizing archaea (AOA) in 2005, their contribution to the global nitrogen cycle is discussed. For better characterization, further understanding of their still largely unknown energy and carbon metabolism is required. In this study, the archaeal ammonia oxidation was investigated, focusing on an enzyme which is potentially involved in the second step as well as possible intermediates. In ammonia oxidizing bacteria (AOB), ammonia oxidation is divided into two steps: first, ammonia (NH3) is oxidized to hydroxylamine (NH2OH, short HA) by the enzyme ammonia monooxigenase (AMO). In the second step, NH2OH is further oxidized to nitrite (NO2-) via the hydroxylamine oxidoreductase (HAO). Although AMO homologs are found in archaea, neither the intermediate, nor the enzyme(s) which catalyze the second step are known. The enzyme studied is a multicopper protein of the AOA, which shows homology to nitrite reductases (NirKs). Due to its high transcription under aerobic conditions and the fact that enzymes can often catalyze their reaction in both directions, it was hypothesized that this enzyme could oxidize an intermediate of ammonia oxidation (probably NO) to NO2-. Apart from biochemical experiments with this protein, also studies with cell extracts and cultures of Ca. Nitrososphaera viennensis (Ca. N. viennensis) were performed to obtain information about possible activities and intermediates in the archaeal ammonia oxidation. The NirK, which was heterologously expressed in Escherichia coli (E. coli), showed no nitrite reductase activity. In the presence of an artificial electron acceptor, it oxidized NH2OH. However, none of the conditions tested yielded detectable amounts of nitrite (partial HAO activity). The results concerning other types of produced nitrogen species (NO, N2O) were inconclusive. The calculated KM value for the reaction, ranging approximately between 0.5 and 1.3 mM, did not show high enzymatic affinity for NH2OH. Since the reduction of the electron acceptor also occurred with copper(II) chloride dihydrate solutions, the enzyme specificity of this reaction could neither be confirmed nor excluded. There was no indication that the NirK is able to oxidize other nitrogen substrates (NO, HNO, NH4+). As the examined enzyme was from a metagenomic library (contig 54d9), it would be beneficial if the NirK of Ca. N. viennensis was available for further studies as well. Therefore, the expression of its NirK in E. coli was attempted. The gene was ligated into the expression vector pET28a but after sequencing of the clones it turned out that the amplified DNA was obtained from EN123, a sister strain of Ca. N. viennensis which was also available in the laboratory. In addition, detection of the NirK in various protein fractions of Ca. N. viennensis was attempted to determine whether its expression as observed in transcriptomic studies can be reproduced in the proteome. However, none of the peptides could be assigned to the respective nitrite reductase. Due to the slow growth and low cell density of Ca. N. viennensis, it became necessary to increase the yield of cells by upscaling the culture to several liters to be able to perform biochemical experiments with crude cell extracts. Ammonium oxidation activity could not be demonstrated in the crude cell extract. HAO activity was only determined indirectly by the reduction of the electron acceptor but again without the formation of nitrite. Further, no evidence for NO activity was found. Interestingly, nitrite reductase activity was detected in the cell extract as well as in the soluble and insoluble fraction of the cell extract. This is an indication of the relevance of this reaction in the organism. Whether this activity is due to the NirK remains unclear. Another experiment to obtain evidence for NO as a possible intermediate in the archaeal ammonia oxidation was the cultivation of Ca. N. viennensis in the presence of a specific NO-scavenger (PTIO, short for 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolineoxyl-1-oxyl-3-oxide). Cultures of Nitrosospira multiformis (AOB) and E. coli served as controls. At comparable concentrations, the growth of Ca. N. viennensis was inhibited most by PTIO. Thus, NO could be an important intermediate of ammonia oxidation. Further, these results give indication for a different ammonium oxidation mechanism, or at least for a different enzymatic machinery of AOA compared to AOB. In this study, the physiologically relevant activity of the NirK homolog could not be clearly determined. However, nitrite reductase activity was detected in cell extracts. As a possible intermediate for ammonia oxidation, only evidence for NO was obtained. Due to the complexity of the process, it seems not easy to track the ammonium oxidation in vitro. Complex electron transfer processes, a variety of enzymes involved and reactive N-species complicate its elucidation. Other biochemical methods must be consulted to further resolve this mechanism.

Autor*innen

Christine Elisabeth Bauer

Haupttitel (Englisch)

Biochemical and physiological investigations on the energy metabolism of ammonia oxidizing archaea

Paralleltitel (Deutsch)

Biochemische und physiologische Untersuchungen zum Energie Metabolismus Ammoniak oxidierender Archaea

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

89 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christa Schleper

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik

AC Nummer

AC10880539

Utheses ID

18186

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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