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Untersuchungen zu Außenmembranproteinen von Umweltchlamydien
Thomas Schott
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Matthias Horn
DOI
10.25365/thesis.20778
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30109.70259.556153-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Außenmembranproteine der obligat intrazellulären Chlamydien spielen, neben der Stabilisierung und der Differenzierung der Zelle im zweiphasigen Entwicklungszyklus, auch bei der Anheftung an die Wirtszellen, der Aufnahme von Nährstoffen und der Abgabe von Stoffwechselendprodukten eine wichtige Rolle. Erste Genomanalysen zeigten wesentliche Unterschiede bezüglich codierter Außenmembranproteine, die auf eine unterschiedliche Zusammensetzung der äußeren Membran der Chlamydiaceae und der Umweltchlamydien Simkania negevensis, Waddlia chondrophila und Parachlamydia acanthamoebae hinweisen (Collingro, Tischler et al. 2011). Hauptbestandteile der Außenmembran der Chlamydiaceae, wie das Porin “Major outer membrane protein“ (MOMP), die polymorphen Membranproteine (Pmps) und die cysteinreichen Proteine OmcA und OmcB, konnten nur teilweise in den Genomen dieser Umweltchlamydien identifiziert werden.
Daher war das Hauptziel dieser Arbeit, die Genomvorhersagen durch eine proteomische Analyse der Außenmembranproteine dieser drei Umweltchlamydien zu bestätigen und darüber hinaus zu ergänzen. Hierfür wurden die Elementarkörperchen (EBs) mittels Ultrazentrifugation über einen Dichtegradienten aufgereinigt, die Außenmembranproteine mit drei verschiedenen Methoden aus den EBs extrahiert und die im Gel verdauten Proteine massenspektrometrisch analysiert. Für S. negevensis konnten - in Übereinstimmung mit in silico-Vorhersagen - in den massenspektrometrischen Messungen der Außenmembranproteinfraktionen weder OmcA noch OmcB identifiziert werden. Als Hauptbestandteil der Außenmembran von S. negevensis wurden hingegen 35 MOMP-ähnliche Proteine identifiziert. Weiters wurden mehrere Kopien des Autotransporters PmpD, sowie zahlreiche uncharakterisierte Proteine in der Außenmembranfraktion gefunden, die es gilt weiter zu analysieren, um ihre Funktion beispielsweise bei Infektionen oder im Entwicklungszyklus zu klären. Der geringe Cysteingehalt der MOMP-ähnlichen Proteine und der insgesamt gefundenen Proteine weist darauf hin, dass der Mechanismus zur Stabilisierung der Außenmembran bei S. negevensis grundlegend anders sein muss. Diese Ergebnisse konnten durch ein Stabilitätsexperiment verdeutlicht werden, in dem die Stabilität von S. negevensis im Gegensatz zu Chlamydiaceae (Hackstadt, Todd et al. 1985) durch die Behandlung mit Dithiothreitol (DTT), das Disulfidbrücken reduziert, nicht beeinträchtigt wurde. Zusätzlich zur Charakterisierung der Außenmembran wurden auch spezifische Antikörper gegen aufgereinigte S. negevensis und P. acanthamoebae EBs hergestellt. Diese Antikörper können für weitergehende Untersuchungen herangezogen werden, um immunodominante Außenmembranproteine zu identifizieren.
Letztlich konnte durch diese Arbeit erstmals ein Einblick in die Zusammensetzung der Proteine in der Außenmembran von S. negevensis EBs gemacht werden, die als Grundlage für die weitere Charakterisierung von Struktur und Funktion dieser Proteine herangezogen werden kann.
Abstract
(Englisch)
Outer membrane proteins of the obligate intracellular chlamydiae play a key role for cell integrity and differentiation during the biphasic developmental cycle, and furthermore, are important for adhesion to the host cells, uptake of nutrients and removal of metabolic waste products. Recently published genome sequences of members of the environmental chlamydiae Simkania negevensis, Waddlia chondrophila and Parachlamydia acanthamoebae showed fundamental differences in the composition of the outer membrane (Collingro, Tischler et al. 2011). Although these organisms share several of the main components of the outer membrane of members of the Chlamydiaceae, e.g. the major outer membrane protein (MOMP), the polymorphic membrane proteins (Pmps) and the cysteine-rich proteins OmcA and OmcB, genes encoding some of these key components were also absent in certain members of the analyzed environmental chlamydiae.
The main objective of this research project was the investigation of the outer membrane proteins of these three environmental chlamydiae to complement and validate the in silico analysis using a proteomic approach. For this purpose, elementary bodies (EBs) of all three organisms were purified via density gradient centrifugation, followed by an extraction of the outer membrane proteins using three different methods and an analysis of the in-gel digested proteins via mass spectrometry. For S. negevensis, outer membrane proteins identified by mass spectrometry matched the in silico predictions. For example, 35 MOMP-like proteins were identified, while OmcA and OmcB were not. We also detected all copies of the autotransporter PmpD encoded in the genome. Additional many uncharacterized proteins in the outer membrane fraction were found, which should be further analyzed, to figure out their possible function in infections or in the developmental cycle. The MOMP-like proteins were highly abundant and contained (like all other found proteins) a low content of cysteines, indicating a different mechanism for stabilizing the outer membrane in S. negevensis. This was further verified by a stability assay, where S. negevensis EBs did not show decreased infectivity rates after treatment with the disulfide-reducing agent dithiothreitol (DTT), in contrast to the influence of DTT on Chlamydiaceae (Hackstadt, Todd et al. 1985). In addition specific antibodies against purified EBs of S. negevensis and P. acanthamoebae were produced, which will help to find immunodominant proteins.
This work provides a first insight in the composition of expressed proteins in the outer membrane of S. negevensis EBs and is therefore useful as a basis for further analysis of the function and structure of these proteins.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Chlamydia Amoeba Simkania negevensis Parachlamydia acanthamoebae Waddlia chondrophila Obligate intracellular Outer membrane Proteins Stability Cysteine
Schlagwörter
(Deutsch)
Chlamydien Amöben Simkania negevensis Parachlamydia acanthamoebae Waddlia chondrophila Obligat intrazellulär Außenmembran Proteine Stabilität Cystein
Autor*innen
Thomas Schott
Haupttitel (Deutsch)
Untersuchungen zu Außenmembranproteinen von Umweltchlamydien
Paralleltitel (Englisch)
Analysis of the outer membrane proteins of environmental chlamydiae
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
108 S.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Matthias Horn
AC Nummer
AC10889175
Utheses ID
18580
Studienkennzahl
UA | 441 | | |