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Method development for the molecular biological detection of food pathogens

Koko Kwisda

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Joachim Seipelt

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DOI

10.25365/thesis.21092

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30314.96942.820559-2

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Obwohl Lebensmittelsicherheit ein Thema ist, das jeden Menschen betrifft, sind die Analysemethoden für Lebensmittelpathogene nach wie vor mikrobiologische Methoden. Diese sind meist zeitaufwendig, nicht sehr genau und können außerdem nur wachstumsfähige Pathogene erfassen. Da Lebensmittel heutzutage global vertrieben werden, ist auch die Geschwindigkeit gestiegen, mit der potenzielle Bedrohungen in Lebensmitteln sich ausbreiten können. Die EU hat außerdem exakte Kontaminationslimits für diverse Pathogene definiert, daher sind schnellere und genauere Detektionsmethoden mehr als notwendig geworden. Die kürzlich entwickelte Probenvorbereitungsmethode Matrix-Lysis kann Lebensmittelmatrizen jeder Art, mit wenigen Ausnahmen, auflösen. Dies hat zum Vorteil, dass das Volumen der zu analysierenden Proben signifikant reduziert wird und sie daher mit einer molekularen Methode, wie beispielsweise real-time PCR, analysiert werden können. Matrix-Lysis besteht aus vier Puffersystemen, von denen zwei die Pathogene intakt lassen und daher auch eine mikrobiologische Untersuchung erlauben. Das Ziel dieser Arbeit war es das Matrix-Lysis System nach der ISO 16140 zu validieren. Im Zuge dessen wurde Matrix-Lysis mit den Standardmethoden ISO 11290-1 und ISO 11290-2 verglichen. Dies resultierte in 100% relativer Genauigkeit, 100% relativer Spezifität und 100% relativer Sensitivität. Außerdem wurde eine internal sample process control (ISPC) als Basis für die Validierung der Analysekette und der quantitativen Detektion in das Matrix-Lysis Protokoll inkorporiert. Die ISPC ermöglicht es, die Effizienz der Detektionsmethode für jede einzelne Probe sowie jedes Puffersystem zu berechnen. Bei der Analyse von natürlich kontaminierten Quargelproben war die so rekalkulierte, anfängliche L.monocytogenes Kontamination um eine Log-Stufe höher als sie ohne die ISPC berechnet worden wäre. Natürlich kontaminierte Proben, die zuvor bei -20°C gelagert worden waren, führten mit Matrix-Lysis und mikrobiologischen Untersuchungen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Daher wurde untersucht, inwieweit eine Langzeitlagerung bei dieser Temperatur die Lebensfähigkeit des Pathogens beeinflusst. Dafür wurde Milch künstlich mit L.monocytogenes kontaminiert und über einen Zeitraum von 56 Tagen sowohl mit Matrix-Lysis als auch der ISO 11290-2 analysiert. Alle vier Puffersysteme zeigen konstante Ergebnisse, die mikrobiologische Methode allerdings weist über den experimentellen Zeitraum einen Verlust von einer halben Log-Stufe auf.

Abstract

(Englisch)

Traditional methods for analysing foods are microbiological methods. These methods rely on growth of a respective pathogen, they are time consuming and also not very accurate. Today, foods are distributed globally and consumed within a few days. Consequently, the speed at which potential hazards are spread has increased, too. The EU has defined exact limits for respective pathogens. To meet these challenges, faster and more accurate detection methods are necessary. The recently developed sample-preparation method MatrixLysis is capable of solubilising many foodstuffs, with the exception of carbohydrate-rich compounds. Disposing of the food matrix and possibly inhibitory compounds allows the analysis of the food sample with a subsequent molecular method like real-time PCR. The MatrixLysis protocol includes four buffer systems, two of which leave the pathogens intact and enable their subsequent microbiological analysis. One aim of this study was to validate the MatrixLysis system according to ISO 16140, comparing it to a standard microbiological method. L.monocytogenes served as model organism, and therefore, MatrixLysis was compared to ISO 11290-2. Comparing the results of both methods yielded 100% relative accuracy, 100% relative specificity and 100% relative sensitivity. Additionally, an internal sample process control (ISPC) as basis for the validation of the analytical chain and quantitative detection will be introduced into the MatrixLysis protocol. It provided a basis for calculating the efficiency of the detection procedure for each sample and every MatrixLysis buffer system. Naturally contaminated quargel samples were analysed and the re-calculated contamination was up to 1 log scale higher than without the addition of the ISPC. Presumptive naturally contaminated samples that had been stored at -20°C yielded different results when treated with MatrixLysis and qPCR rather than the microbiological reference method. Hence, the problem of long term storage and whether it affected a pathogen´s integrity and/or viability was addressed. Milk was artificially contaminated with L.monocytogenes and analysed over a period of 56 days with MatrixLysis as well as ISO 11290-2. All four MatrixLysis buffer systems yielded consistent real-time PCR results, the microbiological method showed a decrease in growth of half a log scale over the experimental time period.

Autor*innen

Koko Kwisda

Haupttitel (Englisch)

Method development for the molecular biological detection of food pathogens

Paralleltitel (Deutsch)

Methodenentwicklung für die molekularbiologische Detektion von Lebensmittelpathogenen

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

76 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Joachim Seipelt

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10881825

Utheses ID

18866

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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