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Enantioselective separation of fluorescence tagged amino acids using chiral anion exchangers
Roland Hellinger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Jeannie Horak
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.21223
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30320.85655.961454-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Im Zuge der Masterarbeit wurde die Enantiomerentrennung von Aminosäuren (AS) unter Verwendung von auf Chinin/Chinidin-basierenden chiralen stationären Phasen untersucht. Die AS wurden N-terminal funktionalisiert, um auf einer Anionenaustauschersäule retardiert zu werden. Dafür wurde ein weit verbreiteter Fluoreszenztag, 6-Aminoquinolin succinimid carbamate (AQC), verwendet. Demgegenüber wurde ein weiteres Label, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), eingesetzt und die Ergebnisse bezüglich ihrer chromatographischen Leistung, wie Enantioselektivität, Auflösung und Retentionsverhalten, verglichen. AQC wurde über eine Harnstoffgruppe und FITC über eine Thioharnstoffgruppe an ein primäres oder sekundäres Amin des Analyten gebunden. Diese Arten von chemischen Brückengruppen wurde bislang noch nicht in Kombination mit Chinin/Chinidin basierenden chiralen stationären Phasen zur enantioselektiven Trennung untersucht. Die verwendeten Substanzen, Aminosäuren, sind mit Ausnahme von Glycin von Natur aus chiral, und kommen beinahe ausschließlich in der (S)- bzw. L-Form vor. Die Spanne von Analyten umfasste die proteinogenen AS, sowie eine Reihe von nicht proteinogenen AS, wie Aminophosphonsäuren, Phenylalaninderivaten- bzw deren Analoga, Sulfon,- als auch Phosphonsäuren, Dipeptide, Phenylalanine- und Alaninpeptide. Die chirale Trennung wurde über Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) durchgeführt. Der chirale Selektor, Chinin/Chinidine, wurde an der C9 Position mit einer tert-Butylcarbamatgruppe versehen. Diese Modifikation führte zu einer sehr hohen Enantioselektivität gegenüber chiralen Molekülen. Betreffend der Wahl eines N-terminalen AS-tags kann das AQC Reagenz als sehr brauchbar eingestuft werden. Mit Ausnahme von Asparagrinsäure, wurden alle proteinogenen AS aufgetrennt. Spezielle Trennungsprobleme, wie die Separation von Stereoisomeren, wurden untersucht. So konnten alle vier Stereoisomere des 4-Hydroxyprolins basislinien rein getrennt werden. Die Threonin Stereoisomere, Threonine, allo-Threonin und Homoserin, wurden aufgelöst, mit der Ausnahme von den ersten beiden eluierenden Enantiomeren, welche kaum retardiert wurden und als eine Analytbande eluierten. Isoleucin Stereoisomere wurden dagegen viel schlechter aufgelöst. Dies kann darauf zurück geführt werden, dass das zweite Stereozentrum in der hydrophoben Seitenkette lokalisiert ist. Die hydrophoben Wechselwirkungen mit dem chiralen Selektor haben aber keinen Anteil an der chiralen Erkennung. Dem zugrunde liegend kann erklärt werden wieso für Isoleucin keine Basislinientrennung bewerkstelligt werden konnte. Schwer zu trennende Dipeptide wie Glycylprolin und Glycylphenylalanine konnten basislinienrein aufgelöst werden. Die Untersuchung von Alaninpeptiden sollte weiteren Aufschluss über die Leistungskraft der AS-label geben und auch über den chiralen Erkennungmechanismus weitere Erkenntnisse liefern. Die erzielten Ergebnisse ergänzen frühere Untersuchungen zu Alaninpeptiden und vervollständigen das erarbeitete Konzept der chiralen Erkennung von Peptiden mit mehreren Stereozentren. Die Abhängigkeit der Enantiomerentrennungen bezüglich des Abstandes der Schutzgruppe zu dem chiralen Zentrum wurden untersucht, ebenso der Einfuss einer achiralen Brücke, wie der eines Glycinrestes in solch einem Peptid. Die Auftrennung der Phenylalaninpeptide war ein weiterer Leistungstest für das angewandte Label. Aufgrund von durchgehend erzielten Basislinientrennungen, mit Ausnahme einiger Stereoisomer der Tri- und Tetrapeptiden, konnte dieser Derivatisierungsreagenz große Komplementariät zu dem tert-butyl-carbamate Chinineselektor zugesprochen werden. Generell stellt die AQC Gruppe, aufgrund von guten Trennleistungen, eine Erweiterung der möglichen N-terminalen Schutzgruppen dar. FITC konnte ebenfalls alle proteinogenen Aminoäuren derivatisieren und die Enantiomere wurden mit ähnlicher Trennleistung wie für die AQC-Derivate aufgetrennt. Die Enantioselekitivität war durschnittlich etwas geringer als bei AQC. Aufgrund von der weitaus kostengünstigeren Verfügbarkeit von FITC, war auch diese fluoreszenz aktive Gruppe sehr attraktiv. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil dieser Masterarbeit war die Synthese und Charakterisierung von auf Chinin basierenden Sulfobetain modifizierten chiralen Selektoren. Drei chirale stationäre Phasen dieses Typus wurden mittels einer Alkylierung unter Verwendung eines Propylsultons hergestellt. Die Alkylierung am Quinucelodinring des nativen Chinins führte zum Selektor der Säule CSP 3. Die gleiche Modifikation wurde an einem tert-butyl carbamate modifizierten Chininanalogon durchgeführt und führte zu CSP 4. Die Alkylierung am Quinolinring des tert-butyl carbamate Analogons ergab CSP 5. Die Säulen wurden auf ihre Fähigkeit zur Enantiomerentrennung getested. Es wurde festgestellt, das die Modifikation an einem der beiden enthaltenen Stickstoffatome unter Einführung einer Sulfonsäuregruppe die Fähigkeit zur Enantiodiskriminierung stark verringert, beziehungsweise völlig auslöscht. Nur für einige Analyte konnte eine Antrennung der Enantiomere erzielt werden. Grundsätzlich kann der Ort der Modifkation, als auch die eingeführte Gruppe dafür verantwortlich gemacht werden. Die Sulfonsäuregruppe und das quaternäre Amin stellen intramolekulare Gegenionen dar und ihre Ladungen können sich gegenseitig abdecken. Die Säulen wurden daraufhin auf ihre Anwendbarkeit in den hydrophilen Interaktionsmodus (HILIC) untersucht. Generell wurden dem Selektormolekül zwei Ladungen zugefügt, wodurch die Polarität des Gesamtmoleküls wesentlich gesteigert wurde. In Bezug auf die Anwendung als HILIC Säulen konnte ermittelt werden, dass eine grundsätzliche Retention von polaren und geladenen Analyten, Nukleoside, Nukleotide, Alkaloide, Säuren, Basen und amphotere Verbindungen, stattfindet. Die Selektivität bezüglich Nukleosiden und Nukleotiden war begrenzt, wogegen geladene und zwitterionische Verbindugen mit hoher Selektivität als auch Effizienz getrennt wurden. Die Modifikation an den Stickstoffatomen des Chinins, unter Einführung einer zweiten starken Ionenaustauschgruppe, führte zu einer Verminderung des chiralen Erkennungssystems. Diese Modifizerung des Chinins war daher nicht zielführend um die chirale Erkennung zu verändern oder zu verstärken. Als HILIC Säulen konnten die Sulfobetainphasen Verwendung finden. Eine höhere Selektorbeladung, sowie die Einführung einer zweite Alkylierung mit einem Akylsulfon, oder einer anderen, mehr HILIC taugliche Gruppe am C9-Atom des Chinins könnte zu mehr Effizienz der Auftrennung von HILIC Verbindungen führen. Die Retention von Analyten auf CSP 3 wurde durch hydrophobe als auch hydrophile Inkremente hervorgerufen. Es wurde auch hydrophiles Retentionsinkrement des tert-butyl carbamat Chininselektors festgestellt, das zu moderaten Retentionen von hydrophilen Substanzen im HILIC Modus führte.
Abstract
(Englisch)
The enantioselective separation of fluorescent labelled amino acids and peptides was investigated. A set of amino acids, all proteinogenic, many non-proteinogenic and dipeptides of biological, pharmaceutical or chemical interest were selected for the investigation. tert-Butyl carbamate-modified quinine/quinidine based chiral stationary phases (CSPs) were used for enantioseparations. Most of the analytes were N-terminal labelled with 6-aminoquinolyl-succinimidyl carbamate (AQC), a common fluorescent tag for quantitative amino acid analysis. As an easy derivatization procedure allowing sensitive quantification, AQC was often used in chiral separation studies. A comparison with fluoresceine-isothiocyanate (FITC) was conducted in the present study, concerning their chromatographic performance on an anion-exchanger-type CSP. FITC was found to yield equal chiral separation potential compared to AQC. Besides the proteinogenic amino acids, the separation of AQC-tagged stereoisomers of 4-hydroxyproline, threonine and isoleucine, of dipeptides like phenyalaninoylglycine and glycoylphenylalanine or prolinoylglycine and glycoylproline was investigated. Further, the separation performance of the AQC reagent was explored using a set of alanine peptides. All-D/all-L peptides up to the hexamer were separated. The investigation of the influence on chiral recognition of one or two non-chiral linkers in di- and tripeptides, namely glycine subunits, either N- or C-terminal located was also part of this study. Enantiomerically pure phenylalanine peptides up to pentamers were also separated. These very lipophilic compounds were known to exhibit an unfavourable character related to chiral separations. The separation of stereoisomers of tri- and tetrapeptides of the before mentioned alanine and phenylalanine peptides was also investigated. The performance of the tert-butyl carbamate modified quinine/quinidine based CSPs was explored, as well as the influence of the stereochemistry on the N- or C-terminus of peptides on chiral recognition. The second part of the master thesis was the synthesis and application of sulfobetaine-type quinine-based chiral stationary phases. A set of native or derivatized amino acids was analyzed with different types of mobile phase. It was found that the alkylation of the nitrogen atoms, either on the quinuclidine or the quinoline ring, had led to strongly reduced or even diminished chiral discrimination behaviour of the quinine selector. The sulfobetaine-type columns were also investigated concerning their applicability in the hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mode. A set of typical HILIC compounds, polar and/or charged substances were separated using mobile phases with different compositions and adjusted pH values. The retention mechanism of the columns was found to be a mixed mode, containing hydrophobic and hydrophilic retention increments. The study also showed that the tert-butyl carbamate quinine-based CSPs has also a hydrophilic retention increment. It was shown that the synthesized sulfobetaine columns can be used as HILIC columns for the separation of highly polar substances. The present master thesis showed the applicability of a fluorescent tag, based on a carbamate linkage group, for the enantioselective separation of amino acids and related compounds on a quinine-based anion exchange-type chiral stationary phase.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
chiral separation enantioseparation fluorescence labeling amino acids chiral stationary phases HILIC
Schlagwörter
(Deutsch)
chirale Trennung Enantiomerentrennung Fluoreszenzmarkierung Aminosäuren chirale stationäre Phasen Chinin HILIC
Autor*innen
Roland Hellinger
Haupttitel (Englisch)
Enantioselective separation of fluorescence tagged amino acids using chiral anion exchangers
Paralleltitel (Deutsch)
Enantioselektive Trennung von Fluoreszenz gelabelten Aminosäuren unter Verwendung von chiralen Anionenaustauscherphasen
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
130 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Wolfgang Lindner
Klassifikationen
35 Chemie > 35.07 Chemisches Labor, chemische Methoden ,
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese ,
35 Chemie > 35.76 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße
AC Nummer
AC10502607
Utheses ID
18984
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1