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The antigenicity of the major grass pollen allergen Phl p 5 expressed in Balb/c mice
Andreas Farkas
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Rudolf Valenta
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30497.98340.665661-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die adaptive Immunität reagiert auf Pathogene indem sie Antigene spezifisch erkennt. Um auf die Vielzahl von Antigenen reagieren zu können, muss die Spezifizierung hochflexibel sein. Diese Flexibilität birgt jedoch auch die Gefahr eine Immunantwort gegen normalerweise harmlose Antigene (z.b. Allergene), mit zum Teil sehr negativen Nebenwirkungen, zu entwickeln. Um dies zu verhindern ist die Entwicklung neuer Ansätze, die eine solche Immunantwort verhindern, von sehr großer Bedeutung. Eine Herangehensweise ist der molekulare Chimärismus, bei welchem Toleranz gegen ein bestimmtes Antigen induziert werden soll. Dies geschieht durch Transplantation von autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSC), die gentechnisch verändert wurden, um ein bestimmtes Antigen zu exprimieren. Nach der erfolgreichen Transplantation kommt es zu einer Koexistenz von modifizierten und unmodifizierten HSC in einem Individuum, was man als molekularen Chimärismus versteht. Unsere Forschungsgruppe hat ein Mausmodell entwickelt, bei welchem HSC einer Balb/c Maus retroviral transduziert werden, um das Graspollenhauptallergen Phl p 5 als Transmembranprotein zu exprimieren. Diese modifizierten HSC werden anschließend in naive Balb/c Mäuse transplantiert, der dadurch entstehende molekulare Phl p 5 Chimärismus führt zu einer spezifischen stabilen Langzeittoleranz gegen Phl p 5. Um die Toleranzinduktion dieses Ansatzes weiter erforschen zu können, wurde eine transgene Maus entwickelt welche ubiquitär Phl p 5 als Transmembranprotein, mit zytoplasmatischer GFP (i.e. grün fluoreszierendes Protein) Co-expression, exprimiert. In dieser Masterarbeit wurde die Phl p 5 Expression der Phl p 5 transgenen Maus durch Durchflusszytometrie, Konfokalmikroskopie und Immunoblotting charakterisiert.
Des Weiteren ist es wichtig, dass ein Antigen ausreichend immunogen ist um als Modellantigen für experimentelle Toleranzinduktion geeignet zu sein. Weshalb im zweiten Teil der Arbeit die Immunogenität des Phl p 5 Transgens bestimmt wurde. Hierfür wurde ein stringentes Toleranzmodell aus der Transplantationsimmunologie gewählt bei welchem Haut von einem Spender auf einen Empfänger transplantiert wird. Sollten sich in der Spenderhaut Antigene befinden, welche vom Immunsystem des Empfängers als ‚Nicht-Selbst’ erkannt werden, wird die Haut abgestoßen. Da sich in unserem Ansatz die Haut der Phl p 5 transgenen Balb/c Maus von einer naiven Balb/c Maus nur durch Phl p 5 und GFP unterscheidet, erlaubte die Geschwindigkeit der Abstoßung einen Rückschluss auf die Immunogenität der Antigene. In diesem Experiment zeigte sich, dass die Haut der Phl p 5 transgenen Maus unerwartet schnell abgestoßen wurde (Medianes Überleben: 9 Tage). Des Weiteren konnten wir zeigen, dass für diese schnelle Abstoßung CD4+ T Zellen nötig sind. Nach der Abstoßung wurden die Phl p 5-spezifischen Antikörper im Serum der Mäuse mittels ELISA bestimmt. Die induzierten Antikörperspiegel waren mit einer subkutanen Immunisierung durch rekombinantes (r)Phl p 5 mit Aluminiumhydroxid vergleichbar. Außerdem wurde gezeigt, dass die induzierten Phl p 5-spezifischen IgE und IgG1 Antikörperspiegel mindestens 58 Wochen lang stabil waren. In einem in vitro Basophil Assay konnte gezeigt werden, dass die Phl p 5-spezifischen IgE Antikörper eine Degranulierung induzieren. In weiteren Versuchen wurden Splenozyten und Splenozytenproteinextrakte der Phl p 5 transgenen Maus subkutan injiziert und die Phl p 5 spezifischen Antikörperspiegel zu verschiedenen Zeitpunkten mittels ELISA bestimmt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass nur Splenozyten eine stabile mindestens 14 Wochen anhaltende Immunantwort induzieren können. Nach Beendigung der Mausexperimente wurde erhöhte Phl p 5-spezifische T-Zellproliferation in Splenozyten von Mäusen, welche hauttransplantiert oder mit Splenozyten behandelt wurden, festgestellt.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Lokalisation von Phl p 5 an der Zellmembran nicht notwendig für die Induktion einer Immunantwort ist. Hierfür wurden murine Zellen transduziert, um entweder membrangebundenes oder zytoplasmatisches Phl p 5 zu exprimieren. Danach werden die Zellen subkutan in naive Balb/c Mäuse injiziert. Anschließend wurden die Phl p 5 spezifischen Antikörperspiegel mittels ELISA bestimmt.
Zusammenfassend ist dieses neuartige Mausmodell ideal zur Erforschung der Toleranzinduktion durch molekularen Chimärsmus geeignet. Zudem könnte dieses Modell sich zur Erforschung der humoralen Immunantworten gegen nicht-MHC Alloantigene eignen, da sich das in murinen Zellen exprimierte Transgen Phl p 5, ohne die Zugabe von Adjuvantien, als hoch immunogen erwiesen hat.
Abstract
(Englisch)
Adaptive immune responses against pathogens are specifically directed towards antigens. To achieve specific immune responses towards the wide variety of antigens, our adaptive immune system has to be highly versatile. This flexibility also holds the potential to react on antigens which are normally innocuous to the individual (e.g. allergens). But immune responses towards innocuous antigens have the potential to do tremendous damage to the individual. Therefore it is of great importance to find new strategies to avoid such immune responses. One approach to those immune responses is molecular chimerism. This approach strives for induction of long-term tolerance towards defined antigens by transplantation of autologous hematopoietic stem cells (HSCs) genetically modified to express the disease causing antigen. Our group has established a murine model whereby Balb/c HSCs are retrovirally transduced to express the major grass pollen allergen Phl p 5 as a membrane anchored protein. The modified HSCs are then transplanted into naïve Balb/c mice leading to a presence of both genetically modified and naïve HSCs (i.e. molecular chimerism). This molecular chimerism leads to specific, stable and long term tolerance towards Phl p 5. To facilitate the further development of tolerogenic cell therapies for allergy, a transgenic mouse expressing membrane-bound Phl p 5 ubiquitously with green fluorescent protein (GFP) co-expression, was generated. In this thesis the Phl p 5-transgenic Balb/c was characterised concerning expression of Phl p 5 in white blood cells by flow cytometry, localisation at the cell membrane by confocal microscopy, and full length expression via immunoblotting. Additionally it is crucial for experimental tolerance induction that the model antigen chosen is immunogenic. Therefore this thesis also strived for the determination of the immunogenicity of Phl p 5 expressed in Balb/c mice. In order to determine the immunogenicity a stringent tolerance model in allotransplantation, the skin graft approach was used. In this approach tail skin of a donor mouse is transplanted onto a recipient mouse. If foreign (i.e. non-self) antigens presented on the skin tissue are immunogenic the skin tissue is rejected by the recipient. The skin of the Phl p 5-transgenic mouse (whose only foreign antigens were Phl p 5 and GFP) was readily rejected in a CD4+ T cell dependent manner after transplantation on naïve Balb/c mice (median graft survival: 9 days). Subsequently Phl p 5-specific antibody levels were determined in sera of mice via ELISA at several time points. Furthermore we determined the immunogenicity of splenocytes and splenocyte cell extracts by subcutaneous injection into naïve Balb/c mice and subsequent Phl p 5-specific ELISAs. We showed that the rejection of tail skin of Phl p 5-transgenic Balb/c mice is capable of inducing a stable levels of anti-allergen antibodies for at least 58 weeks and was comparable to subcutaneous immunisation with recombinant (r)Phl p 5 + aluminium hydroxide (including high levels of Phl p 5-specific IgE). High levels of Phl p 5-specific effector cell mediator release were also found for skin grafted mice in vitro. Additionally splenocytes of the Phl p 5-transgenic Balb/c induced a stable Phl p 5-specific immune response for at least 14 weeks.
Furthermore we found elevated Phl p 5-specific T cell proliferation in vitro in splenocytes of skin grafted and splenocyte treated mice.
To assess whether localisation of Phl p 5 at the cell membrane is crucial for the Phl p 5-specific immune response, NIH-3T3 cells were transduced to express Phl p 5 either as transmembrane protein or cytoplasmically. The transduced cells were then injected subcutaneously and Phl p 5-specific antibody levels were determined via ELISA. Both membrane-bound and cytoplasmic Phl p 5 induced Phl p 5-specific antibodies.
Therefore we conclude that this novel transgenic mouse model is a suitable model for the investigation of tolerance induction via molecular chimerism. Since the transgene Phl p 5 expressed in murine cells appears to be highly immunogenic without adjuvants, it might also serve as a model for a better understanding of humoral immune responses towards non-MHC alloantigens antigens.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Phl p 5 transgenic mouse model immunogenicity antigenicity IgE
Schlagwörter
(Deutsch)
Phl p 5 transgenes Mausmodell Immunogenität Antigenität IgE
Autor*innen
Andreas Farkas
Haupttitel (Englisch)
The antigenicity of the major grass pollen allergen Phl p 5 expressed in Balb/c mice
Paralleltitel (Deutsch)
Die Antigenität des Graspollenhauptallergen Phl p 5 exprimiert in Balb/c Mäusen
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
77 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Rudolf Valenta
Klassifikation
44 Medizin > 44.45 Immunologie
AC Nummer
AC10839560
Utheses ID
19037
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |