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Molecular and structural requirements for kinetochore assembly in Saccharomyces cerevisiae

Peter Hornung

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Stefan Westermann

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DOI

10.25365/thesis.21658

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29531.25465.312365-4

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Alle eukaryotischen Zellen haben zur Übertragung des genetischen Materials komplexe Mechanismen entwickelt. Diese gewährleisten die Weitergabe des Genoms von Generation zu Generationen. Ein wichtiger Bestandteil in diesem System ist das Kinetochor. Es ist ein Multi-Protein Komplex, der auf einem speziellen DNA-Abschnitt, dem Centromer, assembliert und als Ansatzstelle für die Mikrotubuli des Spindelapparates dient. Das Centromere initiiert die Anordnung der ersten Proteinkomplexe auf der centromerischen DNA. Nach und nach wird so ein funktionelles Kinetochore aufgebaut. Der Bauplan für ein eukaryotisches Kinetochor ist universell und das KMN Netzwerk, das aus den Protein Komplexes Knl1, Mis12- und Ndc80 besteht, spielt eine zentrale Rolle um die Mikrotubuli an das Kinetochor zu binden. Ein zweites Proteinnetzwerk ist das Constitutive Centromere Associated Network (CCAN), welches zur Rekrutierung des KMN Netzwerkes benötigt wird. In dieser Arbeit kläre ich teilweise die Protein Konnektivität an der Mikrotubulus-Kinetochor Schnittstelle der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) auf und ich zeige auch wie das KMN Netzwerk mit dem Centromer assoziiert ist. Als erstes begann ich mit der biochemischen Rekonstitution des Mtw1 Komplexes, der das Homolog zum Mis12 Komplex darstellt und ein essentieller Bestandteil des KMN Netzwerkes ist. Der Komplex setzt sich aus den zwei stabilen Heterodimeren Mtw1-Nnf1 und Dsn1-Nsl1 zusammen. Die direkte Veranschaulichung des rekombinanten Mtw1 Komplex mit dem Elektronen Mikroskop zeigte eine elongierte Struktur mit einer durchschnittlichen Länge von 25 nm. In weiteren Experimenten konnte ich nachweisen, dass die Interaktion zwischen dem Mikrotubuli Bindekomplex Ndc80 und dem Mtw1 Komplex auch in der Bäckerhefe konserviert ist und diese durch die Centromer proximalen Spc24-Spc25 Untereinheiten des Ndc80 Komplex geschieht. Der Ndc80 Komplex zeigte nur eine mäßige Mikrotubuli Bindungsaktivität. Jedoch unter der Zugabe des weiteren Mikrotubuli-Bindungskomplex Dam1, der ein wichtiger Bestandteil des äußeren Kinetochor ist, erhöhte sich die Ndc80 Komplex Mikrotubuli-Affinität um das zehn fache. Eine zentrale Frage ist wie der Mtw1 Komplex an das Centromere rekrutiert wird. In humanen Zellen und auch in Fliegen haben Daten suggeriert, dass CENP-C ein CCAN Protein, den Mis12 Komplex rekrutiert. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass mehr als eine CCAN Untereinheit das KMN Netzwerk an das Centromere verankert. Das Homolog zum CCAN in der Bäckerhefe ist der Ctf19 Komplex, dessen Funktion zum größten Teil ungeklärt ist. In Bezug dessen habe ich einen Teil des Ctf19 Komplex rekonstituiert, den COMA Komplex. Dieser besteht aus den Untereinheiten Ctf19, Okp1, Mcm21, Ame1 und wie ich in vitro zeigen konnte direkt mit dem Mtw1 Komplex assoziiert. Ähnlich wie für den vier Untereinheiten Komplex Mtw1 unterteilt sich der COMA in zwei Heterodimere Ame1-Okp1 und Ctf19-Mcm21 und desweiteren assoziiert er mit den zwei zusätzlichen Untereinheiten Chl4 und Iml3. COMA kontaktiert direkt das Mtw1-Nnf1 Heterodimer über ein N-terminales Motiv des konservierten Proteins Ame1. Dieses Motiv ist wesentlich für die Viabilität der Bäckerhefe und seine Deletion reduziert drastisch die Level von Ame1 und Mtw1 Protein am Kinetochor in vivo. Meine Ergebnisse tragen wichtige Informationen zum generellen Kinetochor Aufbau bei und sie erklären möglicherweise auch die essentielle Funktion von Ame1 und Okp1 in der Bäckerhefe.

Abstract

(Englisch)

All eukaryotic cells have developed complex mechanisms to ensure the transmission of genetic material over many generations. One important module in this elaborated system is the kinetochore, a large multi-protein complex that links the chromosomes to the mitotic spindle. Specialized chromosomal domains termed centromeres direct kinetochore assembly to build up a microtubule attachment site. The building plan of kinetochores is likely universal and the conserved KMN network, including the protein complexes KNL-1, Mis12 and Ndc80, plays a central role in the attachment of the spindle microtubules. A second multi-protein structure is the constitutive centromere associated network (CCAN) that is required to recruit the KMN network. In this work, I used biochemical reconstitution experiments and genetic analysis to elucidate the protein connectivity of the kinetochore-microtubule interface in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae or budding yeast) revealing a distinct pathway by which the KMN network is linked to the centromere. First, I started with the biochemical reconstitution of the Mtw1 complex, the homolog of the human Mis12 complex and an essential part of the KMN network. The four-protein complex reconstituted from the two stable heterodimers Mtw1-Nnf1 and Dsn1-Nsl1. Direct visualization by electron microscopy revealed an elongated structure with an approximate length of 25 nm. I could demonstrate a direct interaction between the Mtw1 complex and the centromere proximal Spc24-Spc25 subunits of the microtubule binding Ndc80 complex. The Ndc80 complex alone exerted only moderate affinity for microtubules. Strikingly, in the presence of microtubules and the Dam1 complex, an important constituent of the budding yeast kinetochore-microtubule interface, the Ndc80 complex displayed a 10 fold higher microtubule affinity. A central question is how the Mtw1 complex is recruited to the centromere. Data obtained in human cells and flies suggest a centromere recruitment of the Mis12 complex via the CCAN protein CENP-C. However, it is likely that more than one CCAN subunit anchors the KMN network. The homolog of the human CCAN is the S. cerevisiae protein complex Ctf19, but the biochemical functions of individual subunits have largely remained elusive. I have reconstituted a Ctf19 core complex, called COMA (consisting of Ctf19, Okp1, Mcm21, Ame1) and shown that it directly and stoichiometrically associates with the Mtw1 complex in vitro. Similar to the four-subunit Mtw1 complex, COMA consists of two stable heterodimers Ame1-Okp1 and Ctf19-Mcm21 and it also associates with the proteins Chl4 and Iml3. COMA directly contacts the Mtw1-Nnf1 heterodimer through a conserved motif present in the extreme N-terminus of the CENP-U homolog Ame1. This motif is essential for viability and its deletion drastically reduces the levels of both Ame1 and Mtw1 at the kinetochore in vivo. Together these results define a framework of biochemical interactions required to connect centromeric chromatin to microtubules and they identify important molecular determinants for kinetochore assembly.

Autor*innen

Peter Hornung

Haupttitel (Englisch)

Molecular and structural requirements for kinetochore assembly in Saccharomyces cerevisiae

Paralleltitel (Deutsch)

Molekulare und strukturelle Voraussetzungen für den Kinetochor Zusammenbau in Saccharomyces cerevisiae

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

81 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Tim Clausen ,

Martin Singleton

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10735972

Utheses ID

19361

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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