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Mode of action of non-genotoxic carcinogens
Melanie Pichlbauer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Pavel Kovarik
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30326.19547.944166-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), als besonders aggressiver Tumor, führt zu über einer halben Million Todesfälle pro Jahr. Es ist daher von Bedeutung, die potentiellen Risikofaktoren auszuschalten und die Entstehung dieser Krankheit besser zu verstehen. Viele, an Millionen von Menschen weltweit, verschriebene Medikamente zählen zu der Gruppe von nicht gentoxischen Kanzerogenen (NGC), das heißt sie sind nicht gentoxisch, erzeugen aber Tumore in Ratten in Langzeit „Bioassays“. Die Bedeutung dieser Ergebnisse für den humanen Leberkrebs ist nicht eindeutig. Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Erforschung der Wirkungsweise von prototypischen NGC (Phenobarbital, PB; Cyproterone Acetat, CPA und Wyeth, WY), um das Risiko für die Gesundheit des Menschen besser einschätzen zu können. Bislang lag der Schwerpunkt der Forschung auf Hepatozyten (HC) als direkte Zielzellen von NGC. Da es Hinweise gibt, dass NGC auch auf nicht parenchymale Zellen der Leber (NPC) wirken, wurden die Experimente in der Weise aufgebaut, dass die Effekte von NGC gesondert für HC und NPC untersucht werden konnten.
Die Versuche basierten darauf, dass die Ratten entweder einmalig oder für einen längeren Zeitraum mit PB oder CPA behandelt wurden. Die Zellen wurden mittels Kollagenase Perfusion aus der Rattenleber isoliert, mittels Percoll Gradienten Zentrifugation in HC und NPC aufgetrennt, auf Kulturplatten ausgesät und mit PB, CPA, oder WY für bis zu 24 Stunden behandelt. Die Analyse von veränderten Genexpressionsmustern erfolgte mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), quantitativer Real-Time PCR (qrt-PCR), sowie DNA Chip Analyse des gesamten Transkriptoms. Des Weiteren wurde die Phosphorylierung der „extracellular-signal regulated kinase“ (ERK1/2) Proteine untersucht, die in vitro mit PB oder CPA behandelt worden waren. Die Auswirkung der Zellüberstände von unbehandelten oder PB behandelten NPC auf den pro-entzündlichen Status von HC wurde erforscht. Das Gleiche wurde mit NPC, welche den Zellüberständen von unbehandelten oder PB behandelten HC ausgesetzt wurden, durchgeführt. Die Veränderung der mRNA Level von pro-entzündlichen Genen, wie zum Beispiel des Tumornekrosefaktors (TNFα) oder Interleukin-6 (IL-6), diente als Endpunkt.
Es stellte sich heraus, dass HC hauptsächlich die Nuklearen Rezeptoren (NR) PXR und PPARα und im geringeren Ausmaß CAR und ERα exprimieren. Im Vergleich zu HC waren die Expressionslevel der NR in Endothelzellen und Kupfferzellen geringer oder sogar vernachlässigbar. Es zeigte sich, dass HC in Primärkulturen in der Lage sind auf NGC in Form von erhöhter mRNA der Zytochrom-P450 Isoenzyme (Cyp1a1, Cyp2b1 und Cyp2c12) zu reagieren, wohingegen der Effekt von NGC auf mesenchymale Zellen teilweise geringer ausfiel. Das Gleiche galt für die Phosphorylierung der ERK1/2 Proteine in PB behandelten HC. Zusätzlich ergab die Gene Chip Analyse von HC, welche aus CPA behandelten Tieren isoliert worden waren, eine Hochregulierung von Genen des ERK Signalweges. Infolgedessen könnte dieser Signalweg bei der Wirkungsweise von NGC eine Rolle spielen.
In Bezug auf die epithelialen-mesenchymalen Wechselwirkungen löste das Sekretom aus unbehandelten NPC eine pro-entzündliche Reaktion in HC aus. Diese wurde verschärft, wenn NPC eingesetzt wurden, die aus PB behandelten Tieren stammten. Im Gegensatz dazu führten die Überstände aus unbehandelten HC zu einer Unterdrückung der Transkriptionslevel von pro-entzündlichen Genen in NPC. Dieser Effekt wurde durch den Einsatz von Überständen aus PB behandelten HC noch verstärkt. Die Ergebnisse deuten auf einen fundierten epithelialen-mesenchymalen Dialog hin, welcher zur Feinabstimmung der Expressionslevel in Leberzelltypen dienen könnte. Es wäre denkbar, dass NGC in diese Interaktionen eingreifen.
Zusammenfassend erlangte diese Arbeit Hinweise darauf, dass NGC möglicherweise die Leberkrebsentstehung durch Beeinflussung von Signalwegen und Veränderungen des pro-entzündlichen Status in mesenchymalen und parenchymalen Leberzellen fördern könnte.
Abstract
(Englisch)
As particularly aggressive cancer entity, hepatocellular carcinoma (HCC) causes about half a million deaths per year. Therefore, it is important to eliminate putative cancer risk factors and to understand the mechanisms underlying the pathogenesis of this tumor. Many drugs prescribed to millions of people worldwide belong to the class of non-genotoxic hepatocarcinogens (NGC), i.e. they do not feature genotoxicity but produce tumors in long-term rodent bioassays. The significance of these findings for human liver cancer risk is not clear. This thesis aimed to study the mode of action of prototypical NGC (phenobarbital, PB; cyproterone acetate, CPA; and Wyeth, WY) in order to better estimate whether NGC may pose a risk to human health. Hitherto, research has been focusing on hepatocytes (HC) as direct target cells of NGC. Since there is evidence that NGC are able to act also on non-parenchymal liver cells (NPC), the present study was designed to investigate the effects of NGC, separately for HC and NPC.
As main experimental approaches, rats were treated with PB or CPA either once or for a prolonged period of time. The cells were isolated from rat liver by collagenase perfusion, were separated into HC and NPC by percoll gradient centrifugation, were seeded to culture plates and were treated with PB, CPA, or WY for up to 24 hours. Analysis of altered gene expression patterns was performed via conventional polymerase chain reaction (PCR), quantitative Real-Time PCR (qrt-PCR) as well as by Gene Chip analysis of the whole transcriptome. Furthermore, the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) proteins was analysed in HC and NPC exposed to PB and CPA in vitro. The impact of the secretome of untreated or PB treated NPC on the pro-inflammatory state of HC was investigated. The same was done with NPC exposed to supernatants derived from untreated or PB treated HC. Changes in mRNA level of pro-inflammatory genes, such as the tumor necrosis factor-alpha (TNFα) or interleukin-6 (IL-6), served as end point.
HC were found to express considerably the nuclear receptors (NR) PXR and PPARα and to lower extent CAR and ERα. Compared to HC, the expression levels of NR in EC and KC were lower or even negligible. In primary culture, HC are able to respond to NGC as indicated by elevated mRNAs of cytochrome P450 enzymes (Cyp1a1, Cyp2b1 and Cyp2c12) while the effect on mesenchymal cells was partially weaker. This was similar with the phosphorylation of ERK1/2 proteins in PB-treated cultured HC. Furthermore, Gene Chip analysis revealed the upregulation of components of the ERK pathway in HC exposed to CPA in vivo. As a consequence, NGC action may involve this signalling pathway.
With regard to epithelial-mesenchymal interactions, the secretome from untreated NPC triggered a pro-inflammatory response in HC which was aggravated when NPC had been exposed to PB in vivo. In contrast, supernatants of untreated HC suppressed transcription levels of pro-inflammatory genes in NPC which became more pronounced when supernatant of PB-exposed HC was applied. The results indicate a profound epithelial-mesenchymal dialogue for the fine tuning of expression levels in liver cell types and that NGC may interfere with these interactions.
In summary, the present work could gain evidence that NGC may promote hepatocarcinogenesis by affecting signalling pathways and altering the pro-inflammatory state in both, mesenchymal and parenchymal liver cells.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Hepatocellular Carcinoma non-genotoxic carcinogens phenobarbital cyproterone acetate rat primary liver cells hepatocytes mesenchyme pro-inflammatory genes signalling pathway
Schlagwörter
(Deutsch)
Hepatozelluläres Karzinom nicht gentoxische Kanzerogene Phenobarbital Cyproterone Acetat Primärzellen Hepatozyten Mesenchym pro-entzündliche Gene Signalwege
Autor*innen
Melanie Pichlbauer
Haupttitel (Englisch)
Mode of action of non-genotoxic carcinogens
Paralleltitel (Deutsch)
Der Wirkungsmechanismus von nicht gentoxischen Kanzerogenen
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
91 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Bettina Grasl-Kraupp
AC Nummer
AC10843130
Utheses ID
19372
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |