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Evaluation of protein microarray technology for tumor autoantibody screening in colon cancer
Khulan Sergelen
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Bernd Mayer
DOI
10.25365/thesis.21683
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29836.78266.868264-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Dickdarmkrebs ist die dritthäufigste Krebserkrankung weltweit, mit zunehmender Häufigkeit an Neuerkrankungen in Industrieländern. Die Progression der Erkrankung erstreckt sich über mehrere Jahre, Früherkennung und Diagnose innerhalb eines bevölkerungsweiten Screenings haben die Überlebensrate beträchtlich gesteigert. Da die üblichen klinischen Screening-Verfahren wie fäkaler okkulter Bluttest (FOBT) geringe Sensitivität aufweisen bzw. Koloskopie eine invasive und für den Patient unangenehme Methode darstellen, ist die Entwicklung von serumbasierten minimal invasiven Methoden von hohem Interesse.
Das Konzept von spezifischen molekularen Signaturen in unterschiedlichen Phasen der Tumorgenese und die sich daraus ergebenden tumorassoziierten Antigenen können voraussichtlich als Biomarker in der Krebsdiagnose fungieren.
Tumorassoziierte Antigene wie z.B.: CEA und CA 19.9 finden schon klinische Anwendung, zeigen jedoch niedrige Sensitivität und Spezifität. Außerdem zeigen Studien, dass die Detektion von Krebserkrankungen mit Hilfe eines Tumorbiomarkerpanels höhere Sensitivität und Selektivität zeigt als bei Verwendung einzelner individueller Biomarker.
Es ist bekannt, dass abnorme Expression von Proteinen innerhalb von Tumoren antigenische Eigenschaften aufweist. Diese werden durch das Immunsystem erkannt und draus folgend Tumorautoantikörper (TAA) gebildet. In Kombination mit Protein-Microarray Technologie sind TAAs ein vielversprechender Ansatz für die Entdeckung von Tumorbiomarkern. Jedoch auf Grund der komplexen Natur von Proteinen, zeigen Experimente mit Protein-Microarrays eine niedrige Reproduzierbarkeit, verglichen mit DNA-Microoarrays, und bedürfen daher sorgfältiger Optimierung.
Diese Arbeit präsentiert ein Tumor-Autoantibody Screening von Dickdarmkrebsproben (gesunder Kontrollgruppe, Darmpolypen mit niedrigem Risiko Darmpolypen, Darmpolypen mit hohem Risiko und Dickdarmkarzinom) mittels Protein-Microarrays bestehend aus mehreren tausend Proteinen. Ziel ist es spezifische TAAs zu identifizieren, um ein Kandidatenmarker-Array herstellen und dieses mit einem größeren Probenset zu validieren. Aufgrund der niedrigen Effizienz des konventionellen Assay-Protokolls wurden einige Optimierungen vorgenommen, um so eine standardisierte Arbeitsvorschrift für den Umgang mit den vorliegenden Protein-Microarrays zu erstellen. Wichtige Aspekte bei der Prozessierung der Protein-Microarrays wurden berücksichtigt und auf mögliche Alternativen getestet, wie beispielsweise Protein-Microarray Oberflächen, Blockier- und Puffer chemikalien und experimentelle Bedingungen. Am wichtigsten war es, die Verwendbarkeit von aufgereinigtem IgG für das Tumorautiantikörper Screening zu testen.
Letztendlich wurden einige Veränderungen des Protokolls vorgenommen: Probentestung in rotierenden Kammern bevorzugt gegenüber statischer Feuchtigkeitskammer, Verlängerung der Probentestzeit von zwei auf vier Stunden, Zusatz von Milchpulver zu den Proben, Optimierung der Verdünnung des Detektions-Antikörpers, Ersetzen des Detergenz Tween20 mit Triton X-100 im Puffer und Verwendung von aufgereinigtem IgG besser als Serum. Die Leistung des Tumorantikörper-Kandidatscreenings konnte signifikant, im Bezug auf Sensitivitäten und Spezifizitäten, gegenüber früheren Screenings verbessert werden. Eine Steigerung von ca. 54% auf 97% für die Unterscheidung zwischen Patienten gegen Kontrollen wurde unter der Verwendung von 25 greedy-pairs gene selection für statistische Klassenvorhersage erreicht.
Mit diesem verbesserten Protokoll wurden mittels class prediction analyses 632 Klassifikatorklone, welche 593 Gene repräsentieren, als die am besten vorhersagenden TAAs ausgewählt. Zusätzlich wurden weitere 100 Gene aus publizierten Tumor-Antikörper Screenings mittel Protein-Microarrays in Dickdarmkrebs herangezogen. Die insgesamt 732 Klone werden auf einem Kandidatenmarker-Array zusammengefasst und in der Zukunft für eine Leistungsvalidierung des Arrays mit 384 Proben (unterteilt in 4 Probengruppen) verwendet.
Abstract
(Englisch)
Colorectal cancer is the third ranking cancer type worldwide with increasing incidences in developed countries. Progression of the disease takes several years and early detection and diagnosis following population based screenings has increased survival rate considerably. The screening methods in clinical application such as faecal occult blood test (FOBT) lack sensitivity and colonoscopy is unpleasant and invasive. Therefore, serum based minimal invasive methods are in great demand.
The concepts of specific molecular signatures in the different stages of tumorigenesis, and from there generation of tumor-associated antigens are highly anticipated as biomarkers for applications in diagnostics. Tumor associated antigens such as CEA and CA 19.9 are in clinical applications, but exhibit low sensitivity and specificity. Moreover, many studies have presented that panel of tumor biomarkers show higher sensitivity and specificity in detecting cancer than individual biomarkers.
It is recognized that abnormal expression of proteins in tumors exhibits antigenic ability and are recognized by the immune system, consequently producing tumor autoantibodies (TAA). TAAs in combination with protein microarray technology are a promising approach for tumor biomarker discovery. However, due to the complex nature of proteins, protein microarray experiments have low reproducibility and require careful optimization.
This thesis presents screening for tumor autoantibodies using colon cancer plasma samples of healthy controls, low risk polyps, high risk polyps and colon carcinoma groups utilizing protein microarrays containing several thousand proteins, aiming at identifying specific TAAs for generating a candidate marker array for subsequent validation in larger sample set. Due to the low performance of conventional assay protocols, several optimizations were carried out to establish a standard operating procedure for the particular type of protein microarray. Several aspects important for protein microarray processing were addressed and tested for the possible alternatives, such as protein microarray surfaces, blocking and buffer chemistries, as well as reaction conditions of the assays. Most importantly, the possibility of using purified IgG for tumor autoantibody marker screening was tested.
As a result, several changes to the protocol were made: probing in rotating chambers rather than horizontal humidity chambers, extension of sample incubation from 2 hours to 4 hours, addition of milk powder to samples, and optimization of detection antibody dilutions, replacement of the detergent Tween20 with Triton X-100 in buffers and using purified IgG of samples rather than serum. Tumor autoantibody candidate marker screening performance could be significantly improved from previous screening, with respect to sensitivities and specificities, increasing from ~54% to 97% for distinguishing patients versus controls using 25 greedy-pairs gene selection criteria for class prediction.
With this improved protocol, 632 classifier clones representing 593 genes were deduced from class prediction analyses as the most predictive TAAs. Additionally, 100 genes were selected from published literature on screening for tumor autoantibodies in colorectal cancer using protein microarray technology. This total of 732 clones will comprise the candidate marker array and will be applied in future studies for validation with 384 samples of 4 sample groups: healthy controls, low risk polyps, high risk polyps and colon carcinoma.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Protein mikroarray Tumor-Autoantikörper Dickdarmkrebs
Schlagwörter
(Deutsch)
Protein microarray tumor autoantibody colorectal cancer
Autor*innen
Khulan Sergelen
Haupttitel (Englisch)
Evaluation of protein microarray technology for tumor autoantibody screening in colon cancer
Paralleltitel (Deutsch)
Evaluierung der Protein-Mikroarray Technologie für ein Tumorautoantikörper Screening in Dickdarmkrebs
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
98 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Bernd Mayer
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC10902917
Utheses ID
19381
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |