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Tissue-and tumour-selective targeting of murine leukemia virus-based replication-competent retroviral vectors
Christian Metzl
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Walter Günzburg
DOI
10.25365/thesis.22070
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30097.52580.197663-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Replikationskompetente retrovirale (RCR) Vektoren sind für die Gentherapie sehr interessant, da sie eine hohe Infektionseffizienz und ein gewisses Maß an Tumorselektivität aufweisen. Dennoch ist es wünschenswert, die Tumorselektivität noch zu steigern, und das kann unter anderem durch transcriptional targeting erreicht werden. Hierbei wird der promiskuitive, d.h. in einer Vielzahl von Zelltypen aktive, virale Promoter durch einen tumorselektiven ersetzt.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, einen oder mehrere Promotoren zu charakterisieren, die einem RCR Vektor starke Transgen-Expression und zellselektive Replikation verleihen, dabei aber die genomische Stabilität des Vektors nicht vermindern. Ausgehend von einer umfangreichen Literaturrecherche wurden sieben Promotoren ausgewählt, nämlich die krebsselektiven, zellulären Midkine, c-erbB-2 und AFP Promotoren, der krebsselektive, synthetische CTP4 Promotor, der Lebergewebe-selektive EII-Pa1AT Promotor, sowie der promiskuitive c-fos Promotor, dessen Nutzen als Promoter für retrovirale Vektoren evaluiert werden sollte, und der promiskuitive, virale mCMV Promotor, welcher als Kontrolle diente. Zuallererst wurde die Stärke der Genexpression und die Zellselektivität dieser Promotoren im Kontext eines eGFP-Expressionsplasmids evaluiert. Die vielversprechendsten Promotoren, nämlich die CTP4, EII-Pa1AT und c-fos Promotoren, sowie der mCMV Promotor, wurden danach in einen auf dem murinen Leukämievirus (MLV) basierenden RCR-Vektor inkorporiert, und zwar auf zwei verschiedene Arten: Entweder wurde der gesamte MLV Promotor durch den gesamten heterologen Promoter ersetzt, oder es wurde nur ein Teil des MLV Promoters - bis zum 5' Ende der TATA Box - entfernt und durch den heterologen Promoter, dessen TATA Box entfernt worden war, ersetzt. Während sich ein Vektor unter Kontrolle des c-fos Promotors in Zellkultur nur kaum replizierte, lieferten Vektoren unter der Kontrolle des CTP4 oder EII-Pa1AT Promoters weit bessere Ergebnisse, allerdings nur, wenn die Promotoren auf die zuletztgenannte Weise, bei der die MLV TATA Box erhalten blieb, inkorporiert wurden. Diese Vektoren wiesen starke Transgen-Expression auf und eine Replikationskinetik, die dem parentalen Vektor entspricht, allerdings auf eine zellselektive Art und Weise. Auch ihre genomische Stabilität war der des parentalen Vektors ebenbürtig, und ihre Zellselektivität blieb auch nach mehreren Replikationsrunden erhalten.
Die Ergebnisse dieses Forschungsprojekts wurden 2006 im Journal of Virology veröffentlicht (siehe Kapitel 3), wobei das Hauptaugenmerk auf den Vektoren lag, die den CTP4 oder den EII-Pa1AT Promotor enthielten. Diese Diplomarbeit erweitert diese Publikation um u.a. eine ausführlichere Einleitung, die Präsentation der Vorergebnisse, und eine Beschreibung der weiteren Entwicklung, nachdem dieses Projekt abgeschlossen war.
Abstract
(Englisch)
Replication-competent retroviral (RCR) vectors are very useful for cancer gene therapy, as they exhibit high infection efficiency and a certain degree of tumour selectivity. Improving tumour selectivity is nonetheless desirable, and this can be achieved by transcriptional targeting, whereby the promiscuous viral promoter is replaced by a tumour-selective one.
It was the aim of this study to characterise one or several promoters which confer the desired cell selectivity and high levels of transgene expression onto an RCR vector, while retaining adequate genomic stability.
Based on an extensive literature search, seven promoters were chosen, namely the cancer-selective cellular Midkine, c-erbB-2 and AFP promoters, the cancer-selective synthetic CTP4 promoter, the liver tissue-selective hybrid EII-Pa1AT promoter, as well as the promiscuous c-fos promoter, whose usefulness as a promoter for retroviral vectors was to be evaluated, and the promiscuous viral mCMV promoter, which was used as a ubiquitously active control. In a preliminary experiment, the strength and cell selectivity of these promoters was evaluated in the context of an eGFP expression plasmid. The most promising of them, namely the CTP4, EII-Pa1AT and c-fos promoters, as well as the mCMV promoter, were then incorporated into a Murine Leukemia Virus - based RCR vector in two different ways: In one design, the entire MLV promoter was replaced by the heterologous promoters, whereas in the other design, the portion of the MLV promoter upstream of the TATA box was removed and replaced with the heterologous promoters lacking their TATA box. While a vector bearing the c-fos promoter replicated only poorly in cell culture, vectors containing the CTP4 and EII-Pa1AT promoters performed considerably better - but only in the latter design, in which the MLV TATA box was retained. These vectors exhibited transgene expression levels and replication kinetics similar to the parental vector, but in a cell-selective manner. Also, their genomic stability was on par with the parental vector, and their cell selectivity was retained over several repeated infection cycles.
The results of this research project were published in the Journal of Virology in 2006 (see chapter 3), with the focus on vectors bearing the CTP4 or EII-Pa1AT promoters. This thesis expands on this publication by addition of, amongst others, a more extensive introduction, presentation of preliminary results, and a description of further developments.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
RCR vectors retroviral vectors transcription targeting gene therapy
Schlagwörter
(Deutsch)
RCR Vektoren retrovirale Vektoren Transcription Targeting Gentherapie
Autor*innen
Christian Metzl
Haupttitel (Englisch)
Tissue-and tumour-selective targeting of murine leukemia virus-based replication-competent retroviral vectors
Paralleltitel (Deutsch)
Gewebe-und Tumorselektives Targeting von Maus-Leukämie-Virus - basierten replikationskompetenten retroviralen Vektoren
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
60 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Walter Günzburg
Klassifikation
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC10911588
Utheses ID
19714
Studienkennzahl
UA | 441 | | |