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Molecular interactions between adenoviral RNAs and the cellular RNA interference machinery
Florian Bellutti
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.22135
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29261.80140.939366-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Adenovirale Infektionen in immunsupprimierten Patienten stehen im Zusammenhang mit einer hohen Anzahl an lebensbedrohlichen Komplikationen. Insbesondere nach hämatopoetischen Stammzelltransplantation können disseminierte Infektionen fatale Folgen haben und sind mit einer Mortalitätsrate von bis zu 80% assoziiert (1-5). Derzeit verfügbare Medikamente wie etwa Nukleosid- oder Nukleotidanaloga zeigen nur beschränkte Wirksamkeit gegen Adenovirusinfektionen oder führen zu schwerwiegenden Nebeneffekten (6). Deshalb ist es notwendig, alternative Angriffspunkte für eine therapeutische Intervention zu identifizieren, um die Behandlungsmöglichkeiten solcher Infektionen zu verbessern. Dabei könnte ein grundlegendes Verständnis des Wechselspiels zwischen einem Virus und seiner Wirtszelle zur Entwicklung neuer anti-adenoviraler Behandlungsstrategien beitragen.
Es wurde gezeigt, dass Adenovirus mit der zellulären RNA-Interferenz (RNAi)-Maschinerie interagiert. Dies erfolgt über die Expression von kleinen virus-assoziierten (VA) RNAs. Diese RNAs werden zu miRNA-ähnlichen Subfragmenten (mivaRNAs) prozessiert, welche die Schlüsselenzyme der RNAi – Exportin 5, Dicer und den RNA-induced silencing complex (RISC) – sättigen (7, 8). Es wird angenommen, dass mivaRNAs die Genexpression ihrer Wirtszelle beeinflussen können, indem sie an zelluläre mRNAs binden (9). In dieser Studie wurden verschiedene Aspekte dieser molekularen Interaktionen untersucht.
Um möglichen Ziel-mRNAs von mivaRNAs zu identifizieren wurde eine Immunpräzipitationsmethode angewandt. Dabei wurden Zellen mit mivaRNAs transfiziert und anschließend RISC Komplexe, sowie darin vorhandene miRNAs und deren Ziel-mRNAs biochemisch isoliert. Anschließend erfolgte eine kombinierte Microarray- und Bioinformatik-Analyse der potenziellen Ziel-mRNAs. Diese ergab ein Set an Genen, welche in verschiedenen biologischen Funktionen wie Signaltransduktion, Metabolismus und Immunantwort eine Rolle spielen. Man kann vermuten, dass ein Targeting dieser Gene durch mivaRNAs von besonderer Wichtigkeit für die erfolgreiche Etablierung einer lytischen Virusinfektion ist, oder dazu dienen kann sich während einer latenten Infektion vor dem Wirt zu verbergen.
Des Weiteren wird vermutet, dass mivaRNAs als Schutzmechanismus für virale mRNAs fungieren (7). Die RISC-Immunpräzipitationsmethode wurde dazu verwendet, die Anreicherung viraler mRNAs in der An- oder Abwesenheit der
mivaRNAs zu untersuchen. Dabei wurde eine Virus-Mutante verwendet, welche die VA-RNAs nicht exprimieren kann. Wenn die Mutante anstelle des Wildtyp Virus für die Infektion von A549 Zellen verwendet wurde konnte gezeigt werden, dass bestimmte adenovirale Transkripte in RISC angereichert sind. Diese Beobachtung untermauert die für mivaRNAs vorgeschlagene Funktion als Mediatoren eines molekularen Schutzmechanismus gegen zelluläre RNAi.
Abstract
(Englisch)
Adenovirus infections represent a considerable cause of life-threatening complications in immunocompromised patients. Among hematopoietic stem cell transplant recipients, mortality rates are particularly high, reaching values up to 80% (1-5). Available antiviral drugs such as nucleoside or nucleotide analogues suffer from efficacy against adenovirus infections or show severe side effects (6). Thus, the identification of alternative targets for therapeutic intervention is essential for improving the treatment of such infections. Unraveling the molecular interplay between the virus and its host cell may aid in the development of novel anti-adenoviral treatment strategies.
It has been shown that adenovirus interacts with the cellular RNA interference (RNAi) machinery by expressing small virus-associated (VA) RNAs. These RNAs are processed into micro(mi)RNA-like subfragments (mivaRNAs) which saturate the key enzymes of RNAi, Exportin-5, Dicer, and the Argonaute proteins that make up the RNA-induced silencing complex (RISC) (7, 8). mivaRNAs are suggested to target cellular mRNAs and thus alter host cell gene expression (9). In this study I investigated several aspects of these molecular interactions.
To screen for mivaRNA target mRNAs, I used an immunoprecipitation assay to biochemically isolate RISC and its associated miRNAs and their target mRNAs from mivaRNA-transfected cells. Inspection of these putative targets by microarray analysis and bioinformatics target prediction software revealed a set of genes implicated in various biological functions such as signaling, metabolism and immune response. Targeting of these genes by the virus may be of importance for the successful establishment of a lytic viral infection or may aid in hiding from the host during a latent infection.
Another proposed function of mivaRNAs is the protection of viral mRNA from cellular miRNA-mediated targeting (7). I employed RISC-immunoprecipitation to screen for the enrichment of viral mRNA in the presence or absence of mivaRNAs. When a mutant virus lacking the VA-RNAs was used to infect A549 cells, a set of adenoviral mRNAs was found enriched in RISC. This enrichment pattern differed from that obtained with the wild-type virus, possibly substantiating the proposed function of mivaRNAs to act as defense molecules against cellular RNA interference.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
adenoviruses mRNA miRNA RNA-immunoprecipitation RNAi infection therapy virus immune system defense mechanism
Schlagwörter
(Deutsch)
Adenoviren mRNA miRNA RNA-Immunopräzipitation RNA-Interferenz Infektion Therapie Virus Immunsystem Schutzmechanismus
Autor*innen
Florian Bellutti
Haupttitel (Englisch)
Molecular interactions between adenoviral RNAs and the cellular RNA interference machinery
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Interaktionen zwischen adenoviralen RNAs und der zellulären RNA-Interferenz-Maschinerie
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
101 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Reinhard Klein
AC Nummer
AC10916507
Utheses ID
19768
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |