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Analysis of molecular mechanisms responsible for the assembly and regulation of effector complexes in RNA silencing

Philipp Johannes Franz Leuschner

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Javier Martinez

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DOI

10.25365/thesis.283

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29237.45526.230669-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Herzstück aller RNA silencing Phänomene, hervorgerufen durch kleine RNA-Stränge, ist ein Ribonukleoproteinkomplex (RNP), der in der Minimalvariante aus einem kurzen, einzelsträngigen RNA-Molekül und einem Argonaute Protein besteht. Im Falle von short interfering RNAs (siRNAs) und microRNAs (miRNAs) wird dieser funktionelle Effektorkomplex RNA Induced Silencing Complex (RNA-induzierter Silencing Komplex), kurz RISC, genannt. In dieser Arbeit habe ich analysiert, (a) wie dieser Komplex zusammengefügt wird und (b) wie derartige Assemblierungskaskaden, die letztendlich zu einem funktionellen RNP führen, reguliert werden können. Ich konnte zeigen, dass Argonaute mit einer siRNA beladen wird, die noch doppelsträngig ist. Zudem muss Argonaute den passenger-Strang schneiden, der am guide-Strang gebunden ist, um ihn effizient freizugeben und um RISC in die aktive und funktionelle Konfiguration umzuwandeln. Dieser irreversible Vorgang verstärkt die Asymmetrie einer siRNA, weshalb dies eine wichtige Rolle bei der zukünftigen Konzeption von wirksamen siRNAs spielen könnte, um unspezifische Nebeneffekte zu vermeiden. Kann der passenger-Strang nicht geschnitten werden, wird er durch einen Umgehungsmechanismus intakt freigegeben, allerdings mit einer in hohem Maße reduzierten Geschwindigkeit. Diese Resultate haben Relevanz für miRNA-Duplexe, die interne Wölbungen aufweisen, und für Argonaute Proteine, die keine endonukleolytische Schneideaktivität aufweisen, wo in beiden Fällen der passenger-Strang nicht geschnitten werden kann. Ich konnte auch zeigen, dass die miRNA-Prozessierungskaskade keine starres Standardprogramm ist, das ausgeführt wird, sobald ein miRNA-Gen transkribiert wird. Im Falle von miR-138 wird die Prozessierung des Vorläufertranskripts von einem Inhibitorprotein gesteuert. Dieser Faktor erkennt die Vorläufer-RNA-Haarnadelstruktur und blockiert die finale Prozessierung in allen Geweben mit der Ausnahme von spezifischen neuronalen Zellen und Zellen der fötalen Leber. Diese Resultate haben zu einem besseren Verständnis der miRNA-Genexpression geführt, wo differenzielles Prozessieren einer Vorläufer-miRNA die Funktion der miRNA von ihrem transkriptionellen Status am genomischen Lokus entkoppeln könnte. Wir glauben, dass eine derartige Regulation eine straffe, aber gleichzeitig dynamische Kontolle der miRNA-Genexpression erlaubt und dass dies eine etwas mehr verbreitetere Möglichkeit darstellen könnte, wie die Funktion von miRNAs reguliert wird.

Abstract

(Englisch)

The core of all small RNA silencing phenomena resides in a ribonucleoprotein (RNP) complex that minimally consists of a short, single-stranded RNA molecule and an Argonaute protein. In the case of short interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs), the functional effector complex is called RNA Induced Silencing Complex, or RISC for short. In this work, I have analyzed (a) how this complex is assembled and (b) how such assembly cascades that ultimately lead to a functional RNP can be regulated. I could show that Argonaute becomes loaded with an siRNA, when it is still double-stranded. Furthermore, Argonaute has to cleave the passenger strand, which is bound to the guide strand, to efficiently release it and convert RISC into its active, functional configuration. This irreversible cleavage step enforces siRNA asymmetry. Thus, it may play an important role for the future design of potent siRNAs to mimimize off-target effects. If the passenger strand cannot be cleaved, it becomes removed intact by a bypass pathway, albeit at a greatly reduced speed. This is of relevance for miRNA duplexes displaying internal bulges or for Argonaute proteins lacking endonucleolytic cleavage activity, where in both cases passenger strand cleavage cannot occur. I could also demonstrate that the miRNA production cascade is not a rigid program that is being executed by default whenever a miRNA gene is transcribed. In the case of miR-138, the processing of its precursor transcript is regulated by the action of an inhibitory protein. This factor recognizes the precursor RNA hairpin and blocks the final cleavage step in all tissues with the exception of specific neuronal cells and fetal liver cells. These findings have contributed to a better understanding of how miRNA expression can be regulated. Differential processing of a precursor miRNA may allow the uncoupling of miRNA function from the transcriptional status of its genomic locus. We envision that such regulation enables tight but also dynamic control of miRNA expression and could be a more general way of regulating miRNA function.

Autor*innen

Philipp Johannes Franz Leuschner

Haupttitel (Englisch)

Analysis of molecular mechanisms responsible for the assembly and regulation of effector complexes in RNA silencing

Paralleltitel (Deutsch)

Analyse von molekularen Mechanismen in der Assemblierung und der Regulation von Effektorkomplexen in RNA-Silencing

Publikationsjahr

2007

Umfangsangabe

92 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Helge Grosshans ,

Kazufumi Mochizuki

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC05036136

Utheses ID

199

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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