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Impact of Alternaria toxins on CYP1A1-and GST-expression in human tumour cells

Katharina Anna Domnanich

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*innen

Doris Marko ,

Gudrun Pahlke

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DOI

10.25365/thesis.22773

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29055.45714.718566-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Alternaria Toxine Alternariol (AOH) und Alternariolmonomethylether (AME) wurden von der EFSA auf die Liste der Mykotoxine gesetzt, die noch einer weitgehenden toxikologische Untersuchungen bedürfen, um eine bessere Risikobewertung für Mensch und Tier zu ermöglichen. Der Konsum von Alternaria spp. kontaminierten Getreide wurde in Linxian, China in Verbindung mit Ösophaguskarzinom gebracht. In bereits veröffentlichten Daten von Fehr (2008) und Schreck et al. (2011) wurde die Induktion von CYP1A1 durch Alternaria Toxine beschrieben, was zu weiteren Untersuchungen über die Rolle des Arylhydrocarbon Rezeptors (AhR) in der AME- und AOH-vermittelten CYP1A1 Induktion in humanen Ösophagus Karzinomzellen (KYSE510) veranlasste. Die Frage, ob die Induktion von CYP1A1 mRNA durch Mykotoxine Ah-Rezeptor vermittelt abläuft, wurde in zwei verschiedene Ansätze geklärt. Zuerst wurden AhR-supprimierte Ösophagus Karzinomzellen mithilfe der RNAi Technologie generiert, die ein geeignetes Modell für die Untersuchung des Einfluss der Alternaria Toxine auf CYP1A1 Genexpression darstellten. Zweitens wurde der Ah-Rezeptor in KYSE510 Zellen durch eine Vorbehandlung mit 10 µM MNF inhibiert. Die signifikante Induktion von CYP1A1 in AhR-exprimierenden Zellen (nicht-transfizierte und dsRNA-transfizierte (Negativkontrolle) KYSE510) nach 24 h war abhängig von der applizierten AME- und AOH-Konzentration. Keine Änderungen der CYP1A1 Transkripte wurden bei geringen Mykotoxinkonzentrationen (≤ 0.1 µM) beobachtet, wobei höhere Konzentrationen (≥ 1 µM) eine maximale, 2.5-fache Induktion für AME und eine 8-fache Induktion für AOH hervor riefen. Vergleichbare Ergebnisse in beiden Zelltypen lassen auf keinerlei Veränderungen durch die Transfektion der KYSE510, in Hinblick auf ihre Reaktion auf AME und AOH, schließen. In AhR-supprimierten (AhR-siRNA transfizierten) KYSE510 Zellen waren die CYP1A1 mRNA Level nach der Inkubation mit AME und AOH im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant erniedrigt, was für die AhR-Abhängigkeit der CYP1A1 Induktion spricht. Das Absinken der CYP1A1 Transkripte unterhalb das endogene Level bei hohen Konzentrationen (10 µM AME, 50 µM AOH) lässt auf die Interferenz eines bisher unbekannten Signalweges vermuten. Die Ergebnisse die mithilfe MNF-inhibierter KYSE510 Zellen ermittelt wurden, sind generell in Einklang mit denen, die mit transient siRNA-transfizierten Zellen erzielt wurden und sprechen für eine entscheidende Rolle des Ah-Rezeptors in der AME-vermittelten CYP1A1 Induktion. Glutathion-S-Transferasen (GST) gehören zu den Phase II Enzymen und tragen einen beachtlichen Anteil zur Detoxifizierung von Xenobiotika bei. Nach der Etablierung und Optimierung des GST Assays nach Habig et al. (1973), wurde der Einfluss von AME und AOH auf die GST Aktivitäten in humanen Kolonkarzinomzellen (HT29) untersucht. Ein marginaler, aber doch signifikant erhöhter Anstieg der GST Aktivität bei hohen AOH Konzentrationen (10 µM, 50 µM) lässt auf einen minimalen Beitrag dieser Enzyme in der Detoxifizierung beider Alternaria Toxine schließen.

Abstract

(Englisch)

The Alternaria toxins alternariol (AOH) and alternariol monomethyl ether (AME) are, according to the EFSA, on the list of mycotoxins with an urgent need for further investigations of toxicity, permitting a better risk assessment for man and animal. The consumption of Alternaria spp. contaminated grain is associated with increased incidences of oesophageal cancer in Linxian, China (Liu et al., 1992). Fehr (2008) and Schreck et al. (2011) reported the induction of CYP1A1 by Alternaria toxins, leading to investigations addressing the role of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) in AME- and AOH-mediated CYP1A1 induction in human oesophageal carcinoma cells (KYSE510). The question whether mycotoxin-induced CYP1A1 mRNA levels were AhR-dependent was investigated by two different approaches. Firstly, oesophageal AhR knockdown cells were generated by RNAi technology and were used for studying the impact of Alternaria toxins on CYP1A1. Secondly, the Ah-receptor of KYSE510 cells was inhibited in a pre-treatment with 10 µM MNF prior the incubation with the Alternaria toxins. AOH and AME significantly induced CYP1A1 in a concentration dependent manner in AhR-expressing cells (non-transfected and dsRNA-transfected (negative control) KYSE510) after 24 h of incubation. Any changes in CYP1A1 transcript levels were observed at low mycotoxin concentrations (≤ 0.1 µM), whereas at higher concentrations (≥ 1 µM) CYP1A1 induction peaked by 2.5-fold for AME and 8-fold for AOH. Similar results for both cell types suggested, that the transfection procedure did not influence the response of KYSE510 cells towards AME and AOH. In AhR-suppressed (AhR-siRNA transfected) KYSE510 cells, CYP1A1 levels were significantly reduced after AME- as well as AOH-treatment in comparison to control cells, supporting the AhR-dependence of CYP1A1 induction by both mycotoxins. At high concentrations (10 µM AME, 50 µM AOH), CYP1A1 transcripts plummeted below the endogenous level, giving rise to consider the interference of a putative, yet unknown pathway. The results obtained with MNF-inhibited cells were generally in line with those of transiently siRNA-transfected KYSE510 cells, suggesting a crucial role of the Ah-receptor in AME-mediated CYP1A1 induction. Glutathione-S-transferases (GST) are important phase II drug metabolising enzymes, bearing a considerable role in the detoxification of xenobiotics. After establishment and optimisation of the GST assay according to Habig et al. (1973), the impact of AME and AOH on GST activities in human colon carcinoma cells (HT29) was investigated. Only a marginal, yet significant increase in GST activity at high AOH concentrations (10 µM, 50 µM) was observed, suggesting a minor role of GST in the detoxification of both Alternaria toxins.

Autor*innen

Katharina Anna Domnanich

Haupttitel (Englisch)

Impact of Alternaria toxins on CYP1A1-and GST-expression in human tumour cells

Paralleltitel (Deutsch)

Einfluss von Alternaria Toxinen auf die CYP1A1-und GST-Expression in humanen Tumorzellen

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

159 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Doris Marko

Klassifikationen

35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges ,

35 Chemie > 35.79 Biochemie: Sonstiges

AC Nummer

AC10812333

Utheses ID

20350

Studienkennzahl

UA | 066 | 862 | |

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Schlagwörter