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Characterization of the glycocalyx of the human chondrocyte cell lines C-28/I2 and T/C-28a2 using lectins

Alexander Hifnawy

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Michael Wirth

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DOI

10.25365/thesis.2401

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30483.72904.149759-2

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Für ein besseres Verständnis des Knorpelaufbaus und des Entstehens von degenerativen Gelenkserkrankungen wie beispielsweise Osteoarthritis könnten in-vitro Studien an Chondrozyten-Zellkulturen einen wichtigen Beitrag leisten. Menschliche Primärzellen eines einzelnen Spenders sind aber in entsprechender Menge für groß angelegte Studienreihen nur schwierig zu erhalten und Zellkulturen unterschiedlicher Spender können in Abhängigkeit des Gesundheitszustandes und Alters der Spender sehr unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus besitzen primäre Zellen meist nur eine stark begrenzte Lebensdauer. Allerdings reagieren sie sehr viel ursprünglicher als immortalisierte Zelllinien und entsprechen daher eher den Verhältnissen im Organismus. Da primäre Zellen aber eine in-vivo-ähnliche Umgebung benötigen, ist ihre Kultivierung sehr komplex und erfordert zahlreiche Adaptionen, wie z.B. die der Medienzusammensetzung oder der entsprechenden Kultivierungsoberfläche. Aus all diesen Gründen sollten in der vorliegenden Arbeit immortalisierte Zelllinien eingesetzt werden. Diese Zelllinien haben den Vorteil, dass auf Grund der besseren Verfügbarkeit und Vergleichbarkeit die Durchführung standardisierter und reproduzierbarer Experimente wesentlich einfacher ist. Da aber über deren Charakteristika noch immer relativ wenig bekannt ist, lag das Ziel der vorliegenden Diplomarbeit darin, die Glycocalyx der immortalisierten humanen Chondrozyten-Zelllinien C-28/I2 und T/C-28a2 näher zu untersuchen. Dazu wurden Monolayer dieser Zellkulturen mit fluoreszenzmarkierten Lektinen definierter Bindungsaffinität für verschiedene Zuckerstrukturen inkubiert. Anschließend sollten anhand des gebundenen Anteils der Lektine spektrofluorimetrisch Rückschlüsse auf die Saccharid-Strukturen in der pericellulären Matrix gezogen werden.

Abstract

(Englisch)

To date, little is known about the composition of carbohydrate residues present in the extracellular matrix (ECM) of cultured human chondrocytes. However, this information might be of relevance for studies on cartilage tissue engineering or drug targeting. Therefore, the present study was performed to evaluate the binding patterns and specificities of selected lectins with affinity for distinct carbohydrate structures on C-28/I2 and T/C-28a2 chondrocyte monolayer cultures. Moreover, experiments involving enzymatic pre-treatment of the chondrocyte monolayers aimed at a further characterization of the cultured chondrocyte extracellular matrix. The bioadhesive properties of a panel of fluorescein-labelled lectins with specificities for different carbohydrate structures were investigated by spectrofluorometry. To ascertain the specificity of the lectin-cell interaction competitive inhibition assays using complementary carbohydrates were performed. As compared to that of other lectins, highest binding capacity in both cell lines was yielded with wheat germ agglutinin (WGA), which indicates a notable presence of N-acetyl-D-glucosamine structures as contained in hyaluronan chains. To further specify the binding characteristics of the lectins to the chondrocyte ECM confluent T/C-28a2 cells were pretreated with neuraminidase for digestion of sialic acids prior to incubation with a constant amount of WGA, PNA and STL. After sialic acid digestion only the binding capacity of PNA significantly increased and remained constant upon elevation of neuraminidase concentration. This explicit increase in binding capacity of PNA indicates the successful enzymatic removal of sialic groups, since it is known that PNA is only specific for terminal 2-acetamido-2-deoxy-3-O-ß-D-galactopyranosyl-D-galactose residues which are known to be present in keratan sulfate and masked with sialic acid groups. As compared to PNA, the WGA binding capacity of the chondrocyte ECM only slightly increased. These findings suggest that N-acetylneuraminic acid, the predominant sialic acid, is involved only in low-affinity interactions of WGA. Using N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) as corresponding carbohydrate in competitive assays high inhibition values were observed for both cell lines, indicating a high specificity of WGA for GlcNAc. The results of another assay using chitotriose as competitive inhibitor indicates that WGA seems to bind to internal GlcNAc residues in large oligosaccharides with high affinity. Due to this reason hyaluronidase-digested hyaluronic acid consisting mainly of hyaluronan tetrasaccharides was prepared and used for competitive inhibition. IC50 values observed with these oligosaccharides were several times lower in case of both cell lines as compared to the monosaccharide GlcNAc. We therefore hypothesize that hyaluronan might represent a target structure for WGA in the glycocalyx of cultured chondrocytes. In conclusion, this study could be used as a basis for a more detailed evaluation of the properties of the chondrocyte glycocalyx.

Autor*innen

Alexander Hifnawy

Haupttitel (Englisch)

Characterization of the glycocalyx of the human chondrocyte cell lines C-28/I2 and T/C-28a2 using lectins

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung der humanen Chondrozyten Zelllinien C-28/I2 und T/C-28a2 mit Hilfe von Lektinen

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

42 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Michael Wirth

Klassifikationen

58 Chemische Technik > 58.28 Pharmazeutische Technologie ,

58 Chemische Technik > 58.30 Biotechnologie

AC Nummer

AC07115735

Utheses ID

2047

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter