Detailansicht
DNA elimination in the ciliate Tetrahymena
excision of chromatin by the domesticated piggyBac like transposase Tpb2p
Alexander Vogt
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Kazufumi Mochizuki
DOI
10.25365/thesis.23091
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29718.65936.913160-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Während der sexuellen Fortpflanzung finden im neu entstehenden Makronukleus von
Tetrahymena weitreichende Umgestaltungen des Genoms statt, bei denen mehr als 30 % des
Genoms eliminiert werden. Dieser Prozess beinhaltet die spezifische Erkennung interner
eliminierter Sequenzen durch einen Argonaut-scanRNA Komplex und die darauf folgende
Heterochromatinbildung. Diese führt zur Akkumulierung der methylierten Lysine 9 und 27 des
Histons H3 woraufhin das Chromodomänen Protein Pdd1p rekrutiert wird. Im Anschluss daran
bilden sich sichtbar abgegrenzte Heterochromatinkörperchen von denen man davon ausgeht,
dass in ihnen die DNS Eliminierung stattfindet.
In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die piggyBac-ähnliche Transposase Tpb2p in
diese Heterochromatinkörperchen rekrutiert wird und dass sie für die DNS Eliminierung
unerlässlich ist. Zudem erkennt und schneidet das rekombinant in Bakterien hergestellte Tpb2p
die Grenzen verschiedener interner eliminierter Sequenzen in vitro, wenn diese in der Mitte
einer künstlich ausgearbeiteten und synthetisierten oligo DNS vorhanden sind. Daher führt
Tpb2p wahrscheinlich auch den initialen Doppelstrangbruch während des Ausschneidens der
internen eliminierten Sequenzen aus. Um einen Einblick zu erhalten wie die Präzission während
des Ausschneidens erreicht wird, habe ich die Nuklease Aktivität des rekombinanten Tpb2p
genauer untersucht. Dafür verwendete ich synthetisierte oligo DNS in der jede Position der
linken Grenze des gut untersuchten R-Elements (Sequenz AGTGAT) individuell mutiert wurde.
Ich konnte zeigen, dass die Positionen drei und vier wichtig für ein effektives Schneiden der
Sequenz durch Tpb2p sind. Des Weiteren konnte ich veranschaulichen, dass diese Positionen
auch für die präzise Eliminierung des R-Elements wichtig sind. Daher trägt die Präferenz von
Tpb2p für bestimmte DNS Sequenzen sicherlich zur genauen Eliminierung der internen
eliminierten Sequenzen bei.
Andererseits lokalisiert Tpb2p in den Heterochromatinkörperchen und ist für deren Ausbildung
essentiell. Daher ist es auch möglich, dass Tpb2p direkt mit dem Heterochromatin interagiert,
und dass diese Interaktion die präzise Eliminierung ermöglicht. Tpb2p hat eine Endonuklease
Domäne und eine Zink Finger Domäne. Ich habe herausgefunden, dass die Zink Finger Domäne,
allerdings nicht die Endonuklease Domäne essentiell für die Ausbildung der
Heterochromatinkörperchen ist. Außerdem konnte ich zeigen, dass die Zink Finger Domäne in
vitro an Peptide des Histons H3 bindet, wenn diese an Lysin 9 oder 27 tri-methyliert sind. Dies
lässt die Schlussfolgerung zu, dass diese Modifikationen, die spezifisch sind für interne
eliminierte Sequenzen – zusammen mit der Sequenz Präferenz von Tpb2p – das präzise
Ausschneiden der internen eliminierten Sequenzen vermittelt.
Abstract
(Englisch)
During sexual reproduction the new developing macronucleus of Tetrahymena undergoes
massive programmed DNA rearrangement, where over 30 % of the genome is eliminated. This
process involves the sequence specific recognition of internal eliminated sequences by an
Argonaute-scan RNA complex followed by heterochromatin formation including the
accumulations of methylated histone H3 at lysine 9 and lysine 27 and the chromodomain
protein Pdd1p. This heterochromatin formation eventually leads to the formation of distinct
heterochromatin bodies in which DNA elimination is believed to occur.
In my thesis I demonstrated that the piggyBac-like transposase Tpb2p is recruited to the
heterochromatin bodies and that it is essential for DNA elimination. Furthermore, the
recombinantly expressed Tpb2p from bacteria can recognize and cut boundaries of different
internal eliminated sequences in vitro when they are placed in the middle of an artificially
designed and synthesized oligo. Thus Tpb2p probably introduces the initial double strand break
during DNA excision. To get insight into how the precision of excision is achieved, I first
analyzed the nuclease activity of recombinant Tpb2p in more detail. Using synthesized oligo
DNAs where every position of the reported left boundary of the well studied R element
(sequence AGTGAT) was individually mutated, I found that the third and fourth positions in the
boundary sequence are important for efficient cleavage by Tpb2p. Furthermore, an in vivo
study confirmed that these two positions were crucial for the precise elimination of the R IES
element. Therefore, some DNA sequence preference of Tpb2p clearly contributes to the precise
elimination of internal eliminated sequences.
On the other hand, because Tpb2p is a component of heterochromatin and is required for
heterochromatin body formation, heterochromatin interaction with Tpb2p might also be
involved in the precise DNA elimination. Tpb2p has an endonuclease domain and a zinc finger
domain. I found that the zinc finger domain, but not the endonuclease domain, was essential
for heterochromatin body formation. I could show in vitro that the zinc finger domain binds to
histone H3 peptides that are tri-methylated at lysines 9 or 27 suggesting that these
modifications specific to internal eliminated sequences are - together with the sequence
preference of Tpb2p- specifying the precise IES excision.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
DNA elimination domesticated transposase heterochromatin transposon
Schlagwörter
(Deutsch)
DNS Eliminierung domestizierte Transposase Heterochromatin Transposon
Autor*innen
Alexander Vogt
Haupttitel (Englisch)
DNA elimination in the ciliate Tetrahymena
Hauptuntertitel (Englisch)
excision of chromatin by the domesticated piggyBac like transposase Tpb2p
Paralleltitel (Deutsch)
DNS Eliminierung im Ciliaten Tetrahymena ; Ausschneiden von Chromatin durch die domestizierte PiggyBac aehnliche Transposase Tpb2p
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
91 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Mireille Betermier ,
Leonie Ringrose
Klassifikationen
02 Wissenschaft und Kultur allgemein > 02.13 Wissenschaftspraxis ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC10728163
Utheses ID
20648
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |