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Structure-activity studies on the opening- and closure-mechanism of L-type calcium-channels
Katrin Depil
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Steffen Hering
DOI
10.25365/thesis.23342
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30249.08615.555664-1
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In der vorliegenden Arbeit wurden gating-sensitive Aminosäuren und Sequenzabschnitte in den S6-Segmenten des kardialen L-Typ Kanals Cav1.2 identifiziert und mit Hilfe von Homologiemodellen Hypothesen zu deren Funktion formuliert. Der Großteil dieser Arbeit befasst sich mit der Struktur-Funktionsanalyse des stark konservierten "G/A/G/A" Motivs in der "bundle crossing region" der S6-Segmente.
In den Bereich dieses Motivs fällt eine bekannte, autosomal dominante, Punktmutation, die zu einer Kanalerkrankung, dem Timothy Syndrom, führt. Tritt diese Mutation G432S auf, so sind u.a. Arrhythmien, Autismus und neurologische Defekte die Folge. Dabei wird die Inaktivierung aufgehoben und durch die so verlängerte Kanalöffnungszeit strömt vermehrt Kalzium ein. Die Arbeit zeigt, dass Mutationen in allen analogen Positionen der Domänen II, III und IV starke Verschiebungen der Aktivierung auslösen. Eine Entkopplung des Aktivierungsprozesses vom Inaktivierungsprozess für Mutationen in Position 432 konnte nachgewiesen werden.
Darüber hinaus wurde mittels Homologiemodell festgestellt, dass die Aminosäuren des "G/A/G/A"-Motivs wahrscheinlich einen räumlich dicht gepackten Ring in der geschlossenen Konformation des Kanals bilden. Es wird angenommen, dass dieser bei jeglicher Form der Mutation nicht mehr vollständig schließen kann. Um den Einfluss von Spannungssensoren auf das entdeckte "G/A/G/A" Motiv - und damit das gating-Verhalten - zu untersuchen, wurde jedes S4 Segment der vier Domänen neutralisiert.
Durch die Neutralisierung der S4 Segmente in den Domänen I, III und IV wurde der Kanal funktionsunfähig. Interessanterweise konnte die Aktivierung des neutralisierten Segments in Domäne II (IIS4N) nicht von jener des Wildtypkanals unterschieden werden. Die Kombination von (IIS4N) mit allen "G/A/G/A" Mutanten verursachte ein Rescue-Verhalten, die Wildtyp-Aktivierung wurde also wiederhergestellt. Die Kombination von IIS4N mit den "G/A/G/A" umliegenden Positionen verursachte kein Rescue-Verhalten, was auf eine Schlüsselrolle von "G/A/G/A" für die Kanalöffnung schließen lässt.
Thermodynamische Untersuchungen zeigten, dass der Spannungssensor IIS4 energetisch an den "G/A/G/A" Ring gekoppelt ist und diese Kopplung zu Konformationsänderungen der Domänen II, III und IV führt.
Abstract
(Englisch)
The objective of the present study was to identify gating sensitive positions in the segments of the cardiac L-type Cav1.2 channel. This was supported by homology models that suggested structural details of certain amino acid regions. The main part of this thesis focuses on the highly conserved "G/A/G/A" motif of the bundle crossing region in the S6 segments. A well known autosomal dominant point mutation which causes a channelopathy called Timothy Syndrome is located inside this motif. This inherited disease leads to arrhythmias, autism and neurological defects. The source of this channelopathy is mutation G423S which dramatically reduces inactivation. The prolonged opening of the channel causes increased calcium influx.
This work shows that mutations in all analogous positions in domains II, III and IV accelerate activation. Inactivation in Domains II-IV is not affected. Since inactivation is Domain I specific, a decoupling of the inactivation and the deactivation process can be shown.
Homology modelling demonstrates that all amino acids of the "G/A/G/A" motif form a tightly packed ring in the closed conformation of the channel. We hypothesize that mutating this ring prevents complete channel closure. To investigate influence of voltage sensors on the identified "G/A/G/A" motif, all charged positions in each of the S4 segments were neutralized.
Neutralization of the S4 segments in domains I, III and IV lead to a non-functional channel. Interestingly the activation shift of the neutralized segment in domain II (IIS4N) could not be distinguished from the wild-type channel. Combination of IIS4N with all "G/A/G/A" mutants caused a rescue behaviour with wild-type like activation. In contrast IIS4N in conjunction with amino acid mutations next to the "G/A/G/A" motif showed no rescue behaviour. This indicates the important function of the "G/A/G/A" motif.
Thermodynamic analysis showed that the voltage sensor IIS4 is energetically coupled to the "G/A/G/A" ring. This coupling leads to conformational changes of domains II, II and IV.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
voltage-gated Calcium Channel Structure-Activity Studies
Schlagwörter
(Deutsch)
Spannungsgesteuerter Kalzium Kanal Struktur-Aktivitäsuntersuchungen
Autor*innen
Katrin Depil
Haupttitel (Englisch)
Structure-activity studies on the opening- and closure-mechanism of L-type calcium-channels
Paralleltitel (Deutsch)
Struktur-Aktivitätsuntersuchungen des Öffungs- und Schließverhalten von L-Typ Kalzium Kanälen
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
XIII, 144 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Klaus Groschner ,
Norbert Klugbauer
Klassifikation
44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika
AC Nummer
AC10496213
Utheses ID
20877
Studienkennzahl
UA | 791 | 449 | |