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Diversity in abundance of toxic genotypes in natural populations of Cyanobacteria (Planktothrix spp.)

Eva Maria Schober

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Rainer Kurmayer

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DOI

10.25365/thesis.23469

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30235.95976.609966-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Weltweit wird in vielen Gewässern ein Zuwachs von blütenbildenden Cyanobakterien, z.B. aus den Gattungen Anabaena, Microcystis und Planktothrix beobachtet. Diese Cyanobakterien produzieren viele verschiedene Peptide, zum Beispiel Microcystine und Nodularine, die bekannt für ihre Toxizität sind. Die genetische Basis der toxischen Peptide wurde bereits entschlüsselt, jedoch sind die Umweltfaktoren, die für die Abundanz toxischer Genotypen verantwortlich sind, unbekannt. Da mit Hilfe molekularer Methoden toxische und nicht toxische Genotypen unterschieden werden können, hat vor allem die quantitative PCR (qPCR) Methode zur quantitativen Erfassung einzelner Genotypen an Interesse gewonnen. Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe der qPCR Umweltfaktoren zu identifizieren, die Auftreten und Abundanz verschiedener Peptid-Genotypen in Gewässern beeinflussen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden methodische Probleme zur Anwendung der qPCR geklärt (Kapitel 1). Eine Frage war, welche Filter für die Wasserproben verwendet werden sollen und wie diese Proben bis zur DNA Extraktion am besten gelagert werden. Außerdem war es wichtig zu wissen, auf welche Weise die DNA aus der Phytoplanktonprobe am besten extrahiert werden kann. Experimente zeigten, dass die Proben sowohl gefroren als auch gefriergetrocknet gelagert und verschickt werden können. Ein DNA Extraktions Kit (DNeasy Plant System, Qiagen) war gut geeignet, die DNA aus Freilandproben in relativ kurzer Zeit zu extrahieren, allerdings war die arbeitsintensive konventionelle Phenol-Chlorophorm Extraktion mit osmotischem Schock und Zugabe von Enzymen effizienter. Die methodischen Arbeiten sind auch in einem Manual zur Detektion von toxischen Genotypen in Gewässern, welches für das EU Projekt PEPCY verfasst wurde, beschrieben (Kapitel 4). Die Genauigkeit der qPCR ist durch die linear-logarithmischen Eichgeraden limitiert: So werden die qPCR Messwerte auf einer linearen Skala den entsprechenden DNA Mengen auf einer logarithmischen Skala gegenübergestellt. Daher wurden erstmalig Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der qPCR Messergebnisse zwischen drei unterschiedlichen Instrumenten und Arbeitsgruppen untersucht (Kapitel 2). Dazu wurde mittels qPCR die Häufigkeit des mcyB Genotyps (verantwortlich für die Microcystinsynthese) bei unterschiedlichen Verhältnissen eines toxischen (mit dem mcyB Gen) und eines nicht-toxischen Microcystis Stammes (ohne dem mcyB Gen) bestimmt. Im Besonderen wurden die qPCR Ergebnisse bei einem relativ geringen Anteil an mcyB (0, 2, 4, 6, 8, 10% mcyB) und bei einem höheren Anteil an mcyB (20, 40, 60, 80, 100%) verglichen. Die Messungen aller drei Instrumente ergaben hoch signifikante Regressionsgeraden zwischen dem Anteil des toxischen Stammes und dem Prozentwert des mcyB Genotyps. Obwohl alle Instrumente die Anteile von mcyB im niedrigen (0-10%) sowie im hohen Bereich (20-100%) bestimmen konnten, wurde dennoch dieser Anteil im hohen Bereich (50-100%) überschätzt. Trotzdem konnten alle drei Instrumente die Anteile des mcyB Genotyps auch in Freilandproben über mehrere Monate verfolgen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden während einer zwei Jahre lang dauernden Freilanduntersuchung Peptid Genotypen der Gattung Planktothrix, welche die Produktion der bioaktiven Peptide Microcystin, Aeruginosin und Anabaenopeptin anzeigen, quantifiziert. Die Proben stammen sowohl von Gewässern, die zweiwöchentlich bzw. monatlich beprobt wurden, als auch von gelegentlich beprobten Gewässern. Insgesamt wurden 23 Gewässer aus fünf europäischen Ländern beprobt (Kapitel 3). Dabei wurden mittels qPCR die Genotypen mcyB (Microcystin Synthetase), aerB (Aeruginosin Synthetase) und apnC (Anabaenopeptin Synthetase) in rot und grün pigmentierten Populationen von Planktothrix spp. quantifiziert (n = 159). Die drei Peptid Genotypen wurden über einen weiten Bereich der Populationsdichte (10-6 – 103 mm3 L-1) in praktisch allen Proben nachgewiesen. Überraschenderweise korrelierte die Abundanz der drei Peptidgenotypen hoch signifikant mit der Dichte der gesamten Population. Das durchschnittliche Verhältnis von Microcystin, Aeruginosin und Anabaenopeptin Genotypen war jeweils 53 ± 3% (SE), 16 ± 1% bzw. 50 ± 9%. Populationen von rot und grün pigmentierten Populationen unterschieden sich im Durchschnitt signifikant im Anteil an Microcystin- und Aeruginosin Genotypen. Bei den Anabaenopeptin Genotypen waren die populationsspezifischen Unterschiede weniger deutlich. Diese populationsspezifischen Unterschiede wurden nicht durch saisonal bedingte Schwankungen aufgehoben. Multiple Regressionen ergaben keinen signifikanten Einfluss verschiedener abiotischer (Temperatur, Licht, Nährstoffe) und biotischer Faktoren (Phytoplanktonzusammensetzung) auf den Anteil eines der drei Peptid Genotypen. Daher heben diese Ergebnisse die Rolle von lokalen Umweltfaktoren hervor, die mehr Einfluss auf den Anteil einzelner Peptidgenotypen haben als saisonal variable limnologische Einflussgrößen.

Abstract

(Englisch)

An increase of cyanobacteria is observed in many water bodies all over the world. Cyanobacteria produce a variety of different peptides, e.g. the microcystins and nodularins which are known to be highly toxic. The genetic basis of the toxic peptides has been elucidated but the environmental factors regulating the abundance of toxic genotypes are almost unknown. Quantitative molecular detection tools have gathered substantial interest as those tools are unique in their ability to quantify potential toxic genotypes and their non-toxic counterparts in environmental samples. The central aim of this thesis is the identification of environmental factors regulating the occurrence and abundance of different bioactive peptide genotypes of the filamentous cyanobacterium Planktothrix spp. in lake samples using quantitative PCR (qPCR). In the first part of the thesis methodological problems involved in the application of qPCR were clarified (chapter 1). One question was which filters could be used to harvest phytoplankton and how the samples should be stored until DNA analysis. Further it was important to find out how a maximum of DNA from cyanobacteria collected from field samples could be extracted. Experiments showed that not only freezing but also freeze drying is useful for storing and posting samples. While a commercially available DNA Extraction kit (DNeasy Plant system, Qiagen) was found useful to extract DNA from field samples in a time efficient manner, a conventional phenol-chlorophorm extraction procedure including osmotic shock treatment and enzymatic attack showed a maximum of DNA yield. The methodological problems were also summarized in a manual on genetic techniques submitted as a deliverable of the EU project financing this PhD thesis (chapter 4). The accuracy of the qPCR technique is inherently limited due to its linear-log calibration curves, i.e. standard curves are established by relating the qPCR measurements on a linear scale to the respective DNA amount in the template on a logarithmic scale. Thus the reproducibility and comparability of qPCR measurements was analyzed between three different qPCR instruments and research groups (chapter 2). The qPCR results on the mcyB genotype proportion (indicative of microcystin synthesis) were compared using DNA of a mcy-containing strain and a non-mcy containing strain supplied in different mixtures across a low range of mcyB variation (0, 2, 4, 6, 8, 10%) and across a high range of variation of mcyB (20, 40, 60, 80, 100%). For all three instruments highly significant linear regression curves between the proportion of the toxic strain and the percentage of the mcyB genotypes were obtained. While all instruments were able to follow mcyB proportions both in the low range of mcyB variation (0-10%) as well as in the high range (20-100%) of variation it was also shown that some instruments overestimated or underestimated the real values of toxic genotype proportions in the high range of variation by 50-100%. Despite these limitations in the quantitative estimates all instruments were able to follow the variation in mcyB genotype proportion both within the strain mixture as well as in the field occurring within weeks to months. The second part of the study was the quantification of three genotypes indicative of the biosynthesis of the bioactive peptides microcystin, aeruginosin and anabaenopeptin in the course of a two-years field study, both seasonally as well as in a larger number of 23 occasionally sampled lakes from five European countries (chapter 3): the mcyB (microcystin synthetase), the aerB (aeruginosin synthetase) and the apnC genotype (anabaenopeptin synthetase). The abundance of red or green pigmented Planktothrix spp. was determined by the microscope and by qPCR and varied from extremely rare to bloom formation (10-6 - 103 mm3 L-1, n = 159). The three peptide genotypes occurred in all samples and overall their abundance was linearly related to the total Planktothrix biovolume. The average proportions of the microcystin, aeruginosin and anabaenopeptin genotype were 53 ± 3% (SE), 16 ± 1% and 50 ± 9%, respectively. Averaged over the season populations from red or green pigmented Planktothrix differed significantly in the proportion of the microcystin genotype and the aeruginosin genotype. This difference among red or green pigmented populations was not outweighed by seasonal variation. Multiple regression analysis did not reveal a significant influence of various (a)biotic variables on the seasonal variation in the proportion of any of the three peptide genotypes. In summary it is shown that populations of the same cyanobacterium differ significantly and independently of the season in their average peptide genotype proportion, for example in the proportion of the genotype encoding the synthesis of the toxic peptide microcystin. Consequently, these results highlight the role of local environmental factors that influence population peptide genotype structure much more strongly when compared to seasonal factors.

Autor*innen

Eva Maria Schober

Haupttitel (Englisch)

Diversity in abundance of toxic genotypes in natural populations of Cyanobacteria (Planktothrix spp.)

Paralleltitel (Deutsch)

Verbreitung von bioaktiven Peptidgenotypen in natürlichen Populationen von Cyanobakterien (Planktothrix spp.)

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

135 S. : Ill., graf. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Thomas Hein ,

Thomas Posch

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.93 Limnologie ,

43 Umweltforschung > 43.11 Umweltüberwachung

AC Nummer

AC10500181

Utheses ID

20983

Studienkennzahl

UA | 091 | 444 | |

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