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Cancer drug discovery

establishment of novel organotypic 3-dimensional in vitro models

Nico Jacobi

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Pavel Kovarik

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DOI

10.25365/thesis.23712

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29736.84247.540769-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Um potenzielle Defizite von konventioneller Einzelschichtkultur- und Tiermodellen in der Medikamentenentwicklung zu umgehen, wurden in den letzten Jahren komplexe drei-dimensionale zellbasierte Krebsmodelle entwickelt. Diese dienen als ökologische Nische für eine Vielzahl von unterschiedlichen Zelltypen. 3D Modelle erlauben es die pathophysiologische Komplexität und Heterogenität von Krebs zu imitieren. Daher könnten sie als Basis für robuste und verlässliche in vitro Krebsmo-delle dienen. In zellbasierten 3D Modellen ist es möglich das geeignete Mikroumfeld für viele verschiedene Tumore maßzuschneidern. Nichtsdestotrotz ist noch viel For-schungsarbeit notwendig, um 3D Modelle in der Pharmaindustrie im Bereich der Wirkstoffentwicklung integrieren zu können. In dieser wissenschaftlichen Arbeit haben wir robuste, standardisierte Methoden entwickelt, um 3D Krebsmodelle auf Basis der Tumorsphäroid-Methodik aufzubauen. Sphäroide sind sphärische Zellaggregate, welche sich unter definierten experimen-tellen Kulturbedingungen spontan formen. Da jede Zelllinie individuelle Bedingungen benötigt um Sphäroide zu bilden haben wir unterschiedliche Techniken benutzt. Da-runter befinden sich das „Rotary Cell Culture System“ (RCCS), die „Hanging drop“ und die Methylzellulose-basierten Methoden, sowie nicht-adhärente Oberflächen (Hydrocell™, poly-HEMA Beschichtung). Aufgrund der Fortschritte auf dem Gebiet der Biomaterialien konnten bereits unterschiedliche Matrizen entwickelt werden, die in der Lage sind, den eingebetteten Sphäroiden ein maßgeschneidertes Mikroumfeld zu bieten. Wir haben Sphäroide in natürlichen (Matrigel™, Collagen Typ 1) und syn-thetischen (HyStem™, HydroMatrix™) extrazellulären Matrizen (ECM) eingebettet. Dies ermöglichte heterotypische Ko-Kulturen, die aus Tumor- und Stromazellen be-stehen. Des Weiteren wurden menschliche Lungenzellen und primäre Fibroblasten stabil transduziert, sodass sie Fluoreszenzproteine exprimierten (EGFP, mCFP, J-Red). Damit konnten wir zwischen den unterschiedlichen Zelltypen unterscheiden. So konnten wir definierte Ko-Kulturen generieren, in welchen es möglich ist, Tumor-Stroma Interaktionen zu studieren. Dieses Modell ist ein vielversprechendes Werk-zeug in der Tumorbiologie um die Auswirkungen der Tumor-Stroma Interaktionen auf die Medikamentensensitivität zu studieren. Wir haben bereits einen experimentellen Arbeitsablauf für die automatisierte Generierung von Sphäroiden und Organoiden (eingebettete Sphäroide) definiert, der für Hochdurchsatz-Screenings (HTS) geeig-net sein könnte. Um die Zellphysiologie von organotypischen 3D Modellen genauer charakterisieren zu können, haben wir Affymetrix Gene Chip Analysen durchgeführt. Wir konnten so zeigen, dass die organotypische Kultivierung in 3D ECM Matrizen das Genexpressionsprofil der Krebszellen wesentlich veränderte. Mithilfe von Phospho-Proteom Antikörperarrays konnten wir signifikante Veränderungen in der Phosphorylierung wichtiger Proteine zeigen, sobald die Zellen in 3D kultiviert wurden. Im Besonderen betraf dies den EGF-(Epidermal Growth Factor) Rezeptor. Dieser wurde in den untersuchten Lungenkrebszelllinien, sobald sie drei-dimensional kultiviert wurden, hyperphosphoryliert. Dementsprechend sprachen die 3D Modelle wesentlich sensitiver auf die Behandlung mit dem EGFR Hemmer Gefitinib (Iressa) als Einzelschichtkulturen. In der klinischen Behandlung von Lungenkrebspatienten konnte gezeigt werden, dass das Überleben der Krebszellen stark von der Hyperaktivität des EGF-Rezeptors abhängig war (oncogene addiction). Weiters konnten wir zeigen, dass 3D Modelle ebenso auf das Chemotherapeutikum Paclitaxel anders reagierten. In diesem Fall waren die 3D-kultivierten Zellen resistenter gegenüber dem Therapeutikum als Einzelschichtkulturen. Daher wäre es durchaus denkbar, dass neue wirksame Medikamente nur in 3D-Modell-basierten Wirkstoff Screenings ihre günstige Wirkung offenbaren. Um die Möglichkeit Therapeutika auf deren Wirksamkeit in den etablierten 3D Modellen zu testen, entwickelten wir Protokolle um zellbasierte Assays für Detektion von Zellproliferation und Apoptose durchzuführen (alamarBlue®, Caspase-Glo® 3/7, Annexin V). Mithilfe dieser Assays bestimmten wir die Medikamentenempfindlichkeit von Sphäroiden von vier Lungenkrebszelllinien. Zusammengefasst konnten wir eindeutig zeigen, dass Zellphysiologie und das Ansprechen auf Wirkstoffe in 2D und 3D Krebsmodellen unterschiedlich sein kann. Im Falle vom EGFR-Signalweg konnten nur in den 3D Modellen die klinischen Beobachtungen bestätigt werden (oncogene addiction). Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass noch viel Arbeit nötig ist, um das Potential organotypischer 3D Modelle sowohl für die Grundlagen- und angewandte Krebsforschung als auch für personalisierte Medizin vollständig ausschöpfen zu können. Die Druckversion der Arbeit umfasst Multimediabeilagen (Bilder).

Abstract

(Englisch)

To overcome potential shortcomings of classical monolayer cell culture and animal models in drug discovery, complex three-dimensional cell-based cancer models entered the stage in the last years. These artificial tissue surrogates serve as suitable ecological niches for a multitude of cell types. They allow mimicking the pathophysiological complexity and cellular heterogeneity of cancer in vivo. Therefore they might lay the foundation for a robust and reliable in vitro cancer model. In cell-based three-dimensional models it is possible to tailor the appropriate microenvironment for many individual tumors. However, many research efforts are still necessary in order to fully integrate 3D models into the drug discovery strategies of pharmaceutical industry. In this work we established robust and standardized methods to generate 3D cancer models on the basis of the human tumor spheroid methodology. Spheroids are spherical cell aggregates that tend to form under defined experimental culture conditions. Since each cancer cell line required individual conditions to form spheroids we used different techniques including Rotary Cell Culture System (RCCS), the hanging drop and Methylcellulose-based methods as well as non-adherent surfaces (Hydrocell™, poly-HEMA coating) to generate spheroids. Due to recent advances in the field of biomaterials individually tunable matrices have been developed to provide the embedded spheroids with tailored microenvironment. We embedded spheroids in natural (Matrigel™, Collagen type 1) and synthetic (HyStem™, HydroMatrix™) extracellular matrix (ECM) scaffolds. This facilitated the generation of heterotypic co-cultures consisting of tumor and stromal cells. We stably transduced lung cancer cells and primary human fibroblasts to express fluorescent proteins (EGFP, mCFP, J-Red) which allowed discriminating between the different cell types. We used these cells to establish defined co-cultures of lung cancer spheroids with human lung fibroblasts that may allow studying tumor-stroma interactions. Such co-cultures are considered to be a promising tool in tumor biology for deciphering the effects of tumor-stroma interactions on drug response and drug efficacy in the future. We already established an experimental workflow for the automatized generation of spheroids and organoids that might be amenable to high-throughput drug screening (HTS). To characterize the cell physiology of organotypic 3D models in more detail we performed Affymetrix Gene Chips analyses. We could demonstrate that organotypic cultivation in 3D ECM matrices (Matrigel™/collagen) substantially altered the gene expression profile of cancer cells. Furthermore using defined phospho-protein antibody arrays we revealed differential phosphorylation patterns when cells were cultivated in 3D. In particular, we could show that epidermal growth factor receptor (EGFR) is significantly hyperphosphorylated in the tested lung cancer cell lines cultivated in 3D. In line with these findings the 3D models exhibited a significantly increased sensitivity to the targeted EGFR inhibitor Gefitinib (Iressa) while cancer cells cultivated in 2D were only weakly affected. In the clinic it could be demonstrated that the survival of lung cancer cells in cancer patients was strictly dependent on hyperactivated EGFR signaling (oncogene addiction). Moreover we could demonstrate that 3D models also exhibited different responses to the chemotherapeutic paclitaxel. In this case organotypic cultivation rendered the 3D cells more resistant to paclitaxel than in the 2D cultures. We suggest that new drugs that could have beneficial effects in vivo might be identified only in 3D model-based drug screenings. For the evaluation of drug efficacy within our 3D model, we established 3D cell-based assays for the detection of proliferation and apoptosis (alamarBlue®, Caspase-Glo® 3/7, Annexin V). We used these assays to evaluate drug sensitivity of spheroids generated from four lung cancer cell lines. Taken together, our data clearly demonstrate that cancer cell physiology and drug responsiveness might be clearly different in 2D and 3D cancer models. In the case of EGFR signaling only the 3D models exhibited a drug response that was comparable to clinical observations in cancer patients (oncogene addiction). However, much more work is clearly needed in order to fully exploit organotypic 3D models for basic and applied cancer research and personalized medicine.

Autor*innen

Nico Jacobi

Haupttitel (Englisch)

Cancer drug discovery

Hauptuntertitel (Englisch)

establishment of novel organotypic 3-dimensional in vitro models

Paralleltitel (Deutsch)

Krebsmedikamentenforschung ; Etablierung von neuen organotypischen 3D in vitro Krebsmodellen

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

115 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Pavel Kovarik

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

44 Medizin > 44.81 Onkologie

AC Nummer

AC11044931

Utheses ID

21202

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter