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Molecular characterization of lipid droplet associated proteins in the chicken yolk sac

Thomas Finkes

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Wolfgang Schneider

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DOI

10.25365/thesis.23917

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29912.29388.876970-8

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Haushuhn ist ein sehr wichtiger Modellorganismus. Es gehört, wie alle Vogelarten, Amphibien und Reptilien zu der Gruppe von oviparen Tieren, die Eier legen und bei denen somit beinahe die gesamte Embryonalentwicklung außerhalb des Muttertiers stattfindet. Daher ist besonders das Haushuhn im embryonalen Status für entwicklungsbiologische Studien geeignet. Der Dottersack des sich entwickelnden Embryos spielt dabei in Nahrungstransportprozessen eine tragende Rolle. Der Dottersack arbeitet als eine Form von Verdauungssystem, das Nährstoffe aus dem vom Dottersack umschlossenen Dotter aufnimmt. Der Dottersack ist aus 2 unterschiedlichen Zelltypen aufgebaut. Die untere, dem Dotter zugewandte Schicht, besteht aus einem Epithel aus endodermalen Zellen. Diese nehmen für den Embryo essentielle Nährstoffe aus dem Dotter auf. Direkt den endodermalen Epithelzellen aufsitzend befindet sich die zweite Zellschicht, die mesodermale Schicht aus einem Blutgefäß-Endothel, das Nährstoffe zum Embryo hin transportiert. Mit fortschreitender Entwicklung wird durch das Überwachsen der endodermalen Epithelschicht von dem mesodermalen Endothel die sogenannte area vasculosa gebildet. Jedoch enthält der Dottersack in den ersten Tagen nach der Eiablage große Bereiche von endodermalen Epithelzellen, die nicht von dem mesodermalen Endothel überzogen sind, welche als area vitellina bezeichnet werden. In dieser Studie fand ich heraus, dass die endodermalen Epithelzellen der area vitellina einen großen Einfluss auf die intrazelluläre Fettspeicherung in sogenannten lipid droplets (LDs) haben. Diese Organellen, für die Versorgung des Embryos bereitgestellt, beinhalten zum Großteil neutrale Fette, wie Triglyzeride und Cholesterinester, und sind von einer Phospholipid Monoschicht begrenzt. Ich entdeckte mit Hilfe von qPCR, dass der mRNS Spiegel von PLIN2, einem Mitglied einer LD-assoziierten Protein Familie, der perilipins (PLINs), im Dottersack stark erhöht war. Interessanterweise wiesen die nicht-vaskularisierten endodermalen Epithelzellen der area vitellina, und nicht die vaskularisierten Zellen der area vasculosa, erhöhte Expressionswerte auf. Bisher wurden im Modellorganismus Haushuhn die genauen Funktionen von PLIN2 noch nicht beschrieben. In Säugetieren hingegen wurde herausgefunden, dass PLIN2 an wachsende LDs bindet und von großer Wichtigkeit in der Fettspeicherung ist. Andere PLINs konnten in meinen Untersuchungen nicht detektiert werden. Mit Hilfe der Western blot Technik konnte ich PLIN2 auch auf Proteinebene in der area vitellina nachweisen. Dies lässt auf eine wichtige Funktion von PLIN2 in der Fettspeicherung schließen. Die direkte Assoziation von PLIN2 mit LDs konnte ich in der area vitellina mit einem α-PLIN2 Antikörper mittels Immunofärbung und Konfokalmikroskopie nachweisen. Nachdem ich das Protein, welches mit großer Wahrscheinlichkeit für die Fettspeicherung im Dottersack verantwortlich ist, gefunden hatte, wollte ich herausfinden, wie die Lipide für Verwertung durch den Embryo mobilisiert werden können. Ich suchte nach einem Lipid-hydrolysierendem Enzym, das eine Spezifität für Triglyzerid-Spaltung hat, da dies der Ausgangspunkt für den Abbau von gespeicherten Fetten ist. Ich untersuchte die mRNS von mehreren Triglyzeridspaltenden Enzymen, und konnte tatsächlich eines, mit der Bezeichnung Patatin-like phospholipase domain-containing protein (PNPLA3), entdecken. Die höchsten PNPLA3 mRNS Spiegel wurden in den metabolisch aktiven Zellen der area vasculosa gemessen, also genau dort, von wo aus mit Hilfe der mesodermalen Blutgefäße Nährstoffe zum Embryo transportiert werden.

Abstract

(Englisch)

The chicken is a very important model organism. It belongs, like all other birds, reptiles, and amphibians to the group of oviparous animals that lay eggs, resulting in an almost completely separated embryonic development outside the mother’s body. Therefore, especially the chicken embryo is very suitable for developmental and nutritional studies. The chicken yolk sac (YS) of the developing embryo plays a crucial role in nutrient transfer processes. It functions as a kind of digestive system to provide the embryo with nutrients taken up from the YS-enclosed yolk. It is built up by 2 different cell types. The bottom layer, which is in direct contact to the yolk, consists of an epithelium of endodermal cells which take up essential components provided by the yolk. On top of these endodermal epithelial cells (EECs) lies a mesodermal layer, comprising a blood vessel layer endothelium that transports mobilized nutrients to the developing embryo. With ongoing development, the mesodermal blood vessel layer overgrows and covers the entire EEC layer, in this state named area vasculosa. However, in the first few days after egg deposition the YS contains a significant part of uncovered EECs, which is called area vitellina. In this study I found that the EECs of the area vitellina are of great importance for intracellular lipid storage in cellular organelles called lipid droplets (LDs). The large amounts of lipids, retained for later mobilization to the embryo, are packaged in phospholipid monolayer-enclosed spherical LDs. They consist of neutral lipids, such as triglycerides (TGs) and cholesteryl esters (CEs). The mRNA level, measured by qPCR, of PLIN2 (also called ADRP), a member of a family of LD-associated proteins (the PLINs), was found to be particularly high in the chicken YS. Interestingly, I observed high levels in the unvascularized EECs of the area vitellina, but not in the developmentally advanced vascularized area (the area vasculosa). In many mammalian species PLIN2, not yet demonstrated in the chicken, was found to be associated with nascent LDs and involved in lipid storage. Expression of other PLINs could not be detected in this study. Using Western blotting technique, the protein levels of PLIN2 were determined. The results also point to an important role in the storage of the huge amounts of LDs in the EECs of the area vitellina. The direct association of PLIN2 to the LDs of the EECs of the area vitellina could be visualized by anti-PLIN2 immuno-staining of the area vitellina EECs and subsequent confocal microscopy. After detecting PLIN2, a very potent protein concerning the intracellular storage of neutral lipids, I attempted to reveal how these lipids could be utilized for embryonic nutrition. I searched for (a) lipid hydrolyzing enzyme(s) with specificity for TG hydrolysis, as this is the starting point for degradation of stored lipids. I investigated various TG hydrolyzing enzymes at the mRNA level with qPCR, and could indeed detect one. The candidate is a membrane bound enzyme called Patatin-like phospholipase domain-containing protein (PNPLA3). Indeed, evidence for a role in TG hydrolysis in the YS for PNPLA3 is provided by showing increased expression rates in the area vasculosa, i.e., the metabolically more active tissue. The area vasculosa is very likely also the region from which the nutrients are delivered via the mesodermal blood vessels to the embryo.

Autor*innen

Thomas Finkes

Haupttitel (Englisch)

Molecular characterization of lipid droplet associated proteins in the chicken yolk sac

Paralleltitel (Deutsch)

Molekulare Charakterisierung von Fetttröpfchen assoziierten Proteinen im Dottersack des Haushuhns

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

87 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Wolfgang Schneider

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC11047564

Utheses ID

21386

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter