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Expression and reconstitution of the Trypanosoma brucei IFT complex B core

Structural analysis of the coiled-coil domain of the cytolinker protein plectin

Clara Pleban

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Gang Dong

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DOI

10.25365/thesis.23939

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30394.67115.511754-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Teil I: In den letzten Jahrzehnten ist ein bis dahin kaum charakterisiertes Organell immer mehr in den Blickpunkt neuer Forschungsprojekte gerückt: das Cilium. Dieser Zellfortsatz spielt eine bedeutende Rolle in Signalübertragungswegen und steht in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung diverser Krankheiten. Cilien sind aus einem Mikrotubuli-Axonem aufgebaut, welcher von der Plasmamembran umgeben ist, und über die Zelloberfläche hinaus wächst. Die Grundlage aller funktionierende Cilien ist der bidirektionale Transport der verschiedenen ciliaren Moleküle entlang des Axonems, der von großen Proteinkomplexen durchgeführt wird. Diese Einheiten werden als Intraflagellarer Transport (IFT) - Partikel bezeichnet, der in zwei Subpopulationen unterteilt werden kann: zum einen IFT Komplex A, der für den retrograden Transport verantwortlich ist und ausserdem IFT Komplex B, der unerlässlich für den anterograden Transport ist. IFT Komplex B besteht aus mindestens 14 verschiedenen Proteinen, von denen 8 auch bei hoher Ionenstärke miteinander verbunden bleiben und den Kern des Komplex B bilden. Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit den acht Proteinen des IFT-B Kernes aus dem Organismus Trypanosoma brucei. Um alle Untereinheiten gemeinsam in einem heterologen bakteriellem System zu exprimieren, wurde das pETDuet System verwendet. Um den Komplex aufreinigen zu können, wurden zwei der acht IFT-B Kern Proteine mit einem Affinitäts-Tag fusioniert. Der rekombinante Kern von IFT Komplex B wurde auf eine Chromatographie-Säule geladen, wo er unterschiedliche oligomere Einheiten aufweist; von Aggregaten bis hin zu dem einzelnen Komplex. Die nachfolgenden Versuche fokussierten sich auch die Reinigung einer homogeneren Probe. Biochemische Analysen zeigten, dass wenigstens eine oder mehrere Untereinheiten an Liposomen binden, wobei es noch ungeklärt ist, welche das sind. Der partiell aufgereinigte Komplex kann für biochemische Studien und elektronenmikroskopische Analysen verwendet werden, kristallographische Ansätze sollten in Zukunft mit einem eukaryotischen Expressionssystem verfolgt werden, um eine homogenere Probe zu erhalten. Teil II: Plectin ist ein vielseitiges Zytolinker Protein und besitzt eine ideale Struktur um alle drei wichtigen Zytoskelett-Komponenten – Actin, Mikrotubuli und Intermediäre Filamente - miteinander zu verbinden. Es ist von besonderer Bedeutung in den Hemidesmosomen der Epidermis und den Z-Linien in den Muskelzellen, wo es als Stabilisator fungiert. Verschiedene Mutation in Plectin konnten mittlerweile der Krankheit Epidermolysis bullosa (EB) zugeordnet werden. Diese Krankheit zeichnet sich durch eine besondere Sensitivität der Haut auf jeglichen mechanischen Stress aus, gekennzeichnet durch Blasen- und Wundbildung der Epidermis. Die meisten der Plectin Mutationen werden autosomal rezessiv vererbt, mit Ausnahme einer Mutation von Arginin zu Tryptophan (R>W). Diese Substitution liegt in der Coiled- coil Domäne des Proteins und ist bisher die einzige Mutation von Plectin mit einem dominanten Phänotyp. Um den Einfluß dieser einzelnen Aminosäurenänderung auf die Integrität und Stabilität von Plectin zu untersuchen, wurden verschiedene Abschnitte der Coiled-coil Domäne untersucht. Mittels Elektronenspinresonanz konnte festgestellt werden, dass das Protein ein paralleles Dimer ist, das sich unabhängig von der Mutation in dieser Orientierung bildet. Interessanterweise scheint die Mutation R>W die Fähigkeit von Plectin zu beeinflussen größere Aggregate zu bilden. Inwiefern sich diese Beobachtung funktional mit der Entwicklung von EB korreliert, wird der Fokus zukünftiger Experimente sein.

Abstract

(Englisch)

Part I: Having been neglected as a cellular remnant for nearly a century, the cilium has recently attracted immense interest in current research. Because of the essential roles played by cilia in cell sensing and signalling, the numbers of human pathologies associated with ciliary dysfunctions are increasing. Cilia are microtubule-based structures protruding from the cell surface, encapsulated by the unique ciliary membrane and separated from the cytoplasm by a transition zone. The basis for a functioning cilium is the well-coordinated, bi-directional transport of both ciliary building blocks and turnover products along the microtubule axoneme, which is carried out by large proteinaceous assemblies. These assemblies are termed intraflagellar transport (IFT) particles and are composed of at least 20 different proteins, separated into two distinct sub-populations, termed IFT complex A and IFT complex B, which are respectively responsible for retrograde and anterograde transport within the cilium. The IFT complex B is composed of at least 14 proteins, with eight of them forming a high-ionic strength stable core complex. To characterize these core proteins, I have reconstituted the eight-polypeptide core complex of Trypanosoma brucei in a heterologous bacterial expression system. Analysis of the oligomeric state of the recombinant assembly revealed that the proteins are connected in higher order structures. The reconstituted complex is capable of binding liposomes, but the responsible subunit(s) still needs to be elucidated. The purified complex can be used for further biochemical studies and electron microscopy analyses; for crystallographic approaches a eukaryotic expression system should be used to produce a more homogeneous sample. Part II: Plectin is a versatile cytolinker protein, whose unique domain organization allows it to cross-link the three main cytoskeleton components, intermediate filaments, actin and microtubules. Plectin is of special importance in hemidesmosomes and the z- discs, where it acts as a stabilizer of the structure. A large set of mutations in plectin have been linked to the onset of the human disorder epidermolysis bullosa (EB). This disease manifests itself as a loss of skin integrity and occurrence of skin blisters. Most of the mutations have been identified as autosomal recessive with the exception of Ogna, a substitution of arginine to tryptophan in the coiled-coil domain of the protein. To investigate the influence of this single amino acid change on the functionality of plectin, I have carried out extensive biochemical, biophysical and structural studies on the recombinant coiled-coil domain plectin. The results indicated that the mutation mainly influences the oligomerization ability of plectin. Using electron paramagnetic resonance (EPR) study, the orientation of the coiled-coil protein was identified to be parallel and does not change upon introduction of the arginine to tryptophan mutation. Future studies will be needed to fully understand the influence of the single amino acid change on the integrity of plectin and the development of EB.

Autor*innen

Clara Pleban

Haupttitel (Englisch)

Expression and reconstitution of the Trypanosoma brucei IFT complex B core

Hauptuntertitel (Englisch)

Structural analysis of the coiled-coil domain of the cytolinker protein plectin

Paralleltitel (Deutsch)

Expression und Rekonstitution des IFT Komplex B Kernes Teil ; Strukturanalyse der coiled-coil Domäne des Zytolinkerproteins Plectin

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

130 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Stefan Westermann ,

Kaiyao Huang

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC10731651

Utheses ID

21408

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter