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FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal

Heike Harzer

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Juergen Knoblich

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DOI

10.25365/thesis.24177

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29532.21596.140854-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Stammzellen sind in der Lage, differenzierende und regenerierende Tochterzellen zu produzieren, wobei das Gleichgewicht zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung strikt kontrolliert werden muss. Jede Störung kann entweder zur Degeneration von Geweben oder zur Entstehung von Tumoren führen. Aus diesem Grund ist es wichtig, jene grundlegenden Mechanismen zu verstehen, welche die Balance zwischen Stammzellregeneration und Differenzierung kontrollieren. Dafür nutzen wir in dieser Studie neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten, aus dem larvalen Nervensystem der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch in eine größere, sich selbst erneuernde Stammzelle und eine kleinere differenzierende Zelle, die Ganglion-Mutterzelle (GMC). Während der Zellteilung akkumulieren Zellschicksaldeterminanten an einer Seite der Stammzelle und werden ausschließlich in die GMC segregiert, wo sie ein Differenzierungsprogramm einleiten. Larvale Neuroblasten sind gut geeignet, um genetische Interaktionen zwischen verschiedenen Proteinen zu untersuchen, allerdings ist nicht viel darüber bekannt, welche spezifischen Proteine in den unterschiedlichen neuronalen Zelltypen exprimiert sind. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode, um eine große Anzahl von Neuroblasten sowie ihre differenzierten neuronalen Tochterzellen mittels Fluorescence-activated cell sorting (FACS) aus larvalen Gehirnen zu isolieren. Wir zeigen mit Hilfe von Immunfluoreszenz sowie Expressionsanalysen, dass die sortierten Zellen die korrekte Identität besitzen und die Zellpopulationen nicht mit anderen neuronalen Zelltypen kontaminiert sind. Desweiteren teilen sich die isolierten Neuroblasten in Kultur entsprechend ihrem Verhalten in vivo asymmetrisch und mit ähnlicher Zellzyklusdauer. Die Transkriptomanalyse von Neuroblasten und Neuronen mittels mRNA Sequenzierung ergibt 28 Transkriptionsfaktoren, die im Vergleich zu Neuronen stark in Neuroblasten exprimiert sind. Diese Transkriptionsfaktoren können in einem Netzwerk angeordnet werden, welches auf deren Co-expression in verschiedenen Drosophila Geweben basiert. Dieses Netzwerk enthält Knotenpunkte mit Genen, die wichtige Prozesse in der Stammzelle steuern, wie den Notch Signaltransduktionsweg, die Kontrolle des Wachstums und Chromatinremodellierung. Die Überexpression dieser Neuroblasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren identifiziert Klumpfuss als bisher unbekannten Regulator für die Selbsterneuerung von Neuroblasten. Klumpfuss ist in primären Typ I und II Neuroblasten sowie in gereiften intermediären Vorläufernervenzellen der Typ II Zelllinie exprimiert. Das Protein kann nicht in den direkten Nachkommen der Typ I und II Neuroblasten, den GMCs sowie unreifen intermediären Vorläufernervenzellen, detektiert werden. Wenn Klumpfuss in unreifen intermediären Vorläufernervenzellen dauerhaft exprimiert bleibt, differenzieren diese Zellen zurück zu Typ II Neuroblasten. Dies hat die Entstehung von Hirntumoren zur Folge, aus denen Teile entnommen und in andere Gewebe der Fliege transplantiert werden können wo sie erneut Tumore bilden. Dieses Phänomen kann nicht beobachtet werden, wenn Klumpfuss weiterhin in GMCs vorhanden bleibt. Ein Verlust von Klumpfuss in Neuroblasten hat den Verlust sowie das Schrumpfen von fast allen Typ II und einigen Typ I Neuroblasten zur Folge. Um herauszufinden, wie die Zellschicksaldeterminanten ein Differenzierungs-programm etablieren, indem sie Stammzellfaktoren wie beispielsweise Klumpfuss herunter regulieren und Differenzierungsfaktoren anschalten, separierten wir Neuroblasten und GMCs zu unterschiedlichen Zeitpunkten ihres Reifungsprozesses mittels FACS. Wir analysierten die Expression der 28 Neuroblasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren in einer Zeitreihe von Neuroblasten, unterschiedlich alten Ganglion-Mutterzellen sowie terminal differenzierten Neuronen. Für einige dieser Transkriptionsfaktoren konnten wir einen Anstieg ihrer Expression in GMCs bereits kurz nach der Zellteilung beobachten, während die Expression bekannter Neuroblastenfaktoren erst um den Zeitpunkt der zweiten Neuroblastenteilung herum stark sinkt. Die Identifizierung der Zielgene der Zellschicksal- und Neuroblastendeterminanten mittels knock down Experimenten wird es uns ermöglichen, ein transkriptionelles Netzwerk zu erstellen, welches helfen kann zu erklären, wie Selbsterhaltung der Neuroblasten sowie Differenzierung in GMCs funktionieren.

Autor*innen

Heike Harzer

Haupttitel (Englisch)

FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal

Paralleltitel (Deutsch)

FACS Aufreinigung und Transkriptomanalyse von neuralen Drosophila Stammzellen ergibt eine Rolle fuer Klumpfuss in Stammzellselbsterhaltung

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

136 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Leonie Ringrose ,

Gerhard Technau

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC10730036

Utheses ID

21622

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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