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Regulated gene expression in encapsulated cells

Viktoria Ortner

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Erwin Heberle-Bors

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DOI

10.25365/thesis.24218

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29184.79323.183266-1

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Der Hitzeschock Signalweg ist der wichtigste Abwehrmechanismus von Zellen gegen verschiedene Stressfaktoren. Dabei werden hauptsächlich Hitzeschockproteine produziert, die ein wichtiger Faktor beim Überleben sind. Die Produktion dieser Proteine wird über hoch-induzierbare Bereiche in ihren Promotoren gesteuert, den sogenannten Hitzeschock Elementen (HSE). Diese Eigenschaft macht den Promoter zu einem hervorragenden induzierbaren Expressionssystem für therapeutische Proteine. Ziel dieser Arbeit war es eine Methode für Hitze regulierbare Expression in verkapselten Zellen zu etablieren. Dafür wurde ein künstlicher Hitzeschock Promotor (HSE-Promotor) verwendet und genau charakterisiert. Der Promotor wurde in verschiedenen Zelllinien getestet und auch mit anderen Hitze-induzierbaren Systemen verglichen. Zur genaueren Charakterisierung wurde eine stabile Zelllinie mit integriertem HSE Promotor hergestellt. Mit dieser Zelllinie wurde getestet, ob der Promotor auf verschiedene Stress-Faktoren reagiert und wie diese Reaktion mit dem natürlichen Signalweg vergleichbar ist. Es konnte gezeigt werden, dass der HSE Promoter sehr hohe Produktionsraten erreichen kann, wobei ohne Aktivierung kaum Expression zu sehen war. Zusätzlich reagiert der HSE Promoter zwar stark auf Hitze, nicht jedoch auf viele andere natürliche Stressfaktoren, was ihn zu einem idealen Kandidaten für eine Anwendung in der Gen- und Zelltherapie macht. Auch das Überleben der Zellen nach Stressbehandlung zeigte kaum eine Beeinträchtigung. Bei der Zelltherapie können genetisch modifizierte Zellen an Patienten angewendet werden. Verkapselung schützt diese Zellen vor dem Immunsystem, daher können die heterologen Zellen im Patienten überleben und Wirkstoffe produzieren. Allerdings fehlen bis jetzt effiziente Methoden, um diese Wirkstoffproduktion zu regulieren. Wir haben ein induzierbares Expressionssystem auf Basis eines artifiziellen Hitzeschock Promotors entwickelt. Durch Verkapselung der Zellen zusammen mit magnetischen Nanopartikeln kann die notwendige Erwärmung in den Kapseln durch ein alternierendes Magnetfeld erreicht werden. Um das System zu etablieren wurde die HSE Zelllinie mit magnetischen Nanopartikeln gemischt und durch ein magnetisches Wechselfeld aktiviert. Dabei konnten optimale Bedingungen für die Proteinexpression gefunden werden und zusätzlich eine Regulation dieser Produktion durch verschiedene Magnetpartikel-Mengen, Induktionszeiten und Magnetfeldstärken erreicht werden. Um einen Proof-of-Principle für das System zu erbringen, wurden die Zellen gemeinsam mit den Magnetpartikeln verkapselt und im Magnetfeld induziert. Dieser Versuch zeigte eine hohe Proteinproduktion durch die Induktion im Magnetfeld. Somit konnte der Erfolg dieser neuartigen Methode gezeigt werden.

Abstract

(Englisch)

The heat shock response is the most prominent reaction of cells to different stressful conditions. As a result, the cells strongly induce the promoters of heat shock proteins to cope with the stress. This property is the basis for an application of such promoters in therapeutic gene expression. The aim of this work was to establish a system for heat inducible expression in encapsulated cells. A newly designed artificial heat shock promoter (HSE-promoter) was characterised for its application in regulated gene expression in detail. First its inducibility was tested in different cell lines and compared to other heat responsible promoters. In order to analyse the promoter in more detail a stable cell line was generated. Different established heat shock inducers were tested for their ability to activate the artificial HSE-promoter and compared to induction of endogenous heat shock promoters. In addition, detailed expression kinetics of both the artificial and the endogenous promoter were performed. By this means it was demonstrated that the artificial HSE-promoter leads to higher reporter gene expression with lower background levels in different cell lines. Furthermore, the artificial promoter responded almost exclusively to heat and not to other natural triggers like hypoxia. Cell survival after heat induction was analysed and resulted in a non-significant decrease in viability. These superior properties make this promoter an ideal tool in gene or cell therapy applications. Cell therapy provides a strategy to administer genetically modified cells to patients. When incorporated into cellulose sulphate microcapsules, these cells are protected from the host immune system and remain localised to the area of implantation. Thus even heterologous cells survive in the patient and can produce therapeutic substances over several months in the target tissue. In order to externally regulate the expression of the therapeutic gene, the heat inducing properties of magnetic nanoparticles were applied. Therefore the cells were exposed together with magnetic nanoparticles to an alternating magnetic field. The experiments revealed a tight regulation of the HSE-promoter over several orders of magnitude by variation of nanoparticle concentration, induction time and magnetic field strength. After encapsulation of the cells together with magnetic nanoparticles a first proof-of-principle in vitro was performed. The magnetic field induced the cells to express high levels of the marker gene luciferase. Taken together it was possible to develop an inducible expression system for encapsulated cells tightly controlled from the outside.

Autor*innen

Viktoria Ortner

Haupttitel (Englisch)

Regulated gene expression in encapsulated cells

Paralleltitel (Deutsch)

Regulierte Genexpression in verkapselten Zellen

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

125 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Ernst Müllner ,

Christian Plank

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10731617

Utheses ID

21652

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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