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A novel strategy for the isolation of cardiovascular progenitor cells from murine hearts

Philipp Heher

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Georg Weitzer

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30126.99164.709165-9

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache weltweit, 30% aller Menschen weltweit sterben daran. Die Tatsache dass Herz-Kreislauf-Erkrankungen jährlich mehr Todesopfer als alle anderen Krankheiten fordern hat die kardiovaskuläre Forschung in der Vergangenheit stark forciert. Jahrzehnte lang wurde das Herz für ein post-mitotisches Organ gehalten, wodurch der unausweichliche Verlust von Kardiomyozyten nach einem Herzinfarkt irreversibel wäre. Die Entdeckung eines intrinsischen Regenerationspotentials des Herzens durch endogene adulte Herzstammzellen hat die klinische kardiovaskuläre Forschung mit der Entwicklungs- und Stammzellbiologie vereint. Seitdem ist es zwar mehreren Forschungsgruppen gelungen somatische Herzstammzellen aus Herzen verschiedener Säugetiere zu isolieren, jedoch nicht, diese Zellen in vitro über längere Zeiträume als phänotypisch stabile, klonale und selbsterneuerungsfähige Zelllinien zu kultivieren. Hier stellen wir eine simple und robuste Strategie zur Isolierung von Herzstammzellen aus Herzen von frisch geborenen und adulten Mäusen vor. Wir verwenden ein Drei-Komponenten-Kultursystem bestehend aus somatischen Herzzellen, embryonalen Stammzellen und LIF sekretierenden Feeder Zellen mit selektierbaren Markern, um eine künstliche in vitro Stammzellnische zu simulieren, die das Überleben und Wachstum der Herzstammzellen ermöglicht, bis stabile, klonale Zelllinien etabliert werden können. Wir zeigen, dass die isolierten Herzstammzellen tatsächlich aus dem murinen Herz stammen und nicht durch Zellfusion, Transdifferenzierung oder Reprogrammierung entstandene Zellkultur-Artefakte sind. LIF ist notwendig und ausreichend für die Selbsterneuerung von Herzstammzellen, im Gegensatz zu murinen embryonalen Stammzellen differenzieren Herzstammzellen jedoch bei LIF-Entzug überwiegend zu funktionellen Kardiomyozyten, glatten Muskelzellen und Endothelzellen, den drei Hauptzelltypen des Herzens. Dieses limitierte in vitro Differenzierungspotential und die gleichzeitige Expression von Stammzell-, frühen mesodermalen und Herzzellmarkern in undifferenzierten Herzstammzellen deuten darauf hin, dass diese Zellen bereits auf die Differenzierung zu Herzzellen eingeschränkt sind. Zusätzlich demonstrieren wir unter Verwendung des embryoid body Modellsystems, dass Herzstammzellen in einem größeren Ausmaß zu funktionellen Kardiomyozyten und glatten Muskelzellen differenzieren und stärker auf biochemisch induzierte Herzdifferenzierung durch kardiogene Substanzen wie MK142 oder Cardiogenol-C reagieren als embryonale Stammzellen. Wir konnten Herzstammzellen bisher über 147 Passagen kultivieren, ohne Veränderungen im Phänotyp, Karyotyp oder Differenzierungspotential der Zellen zu beobachten. Die Stabilität der Herzstammzellen in vitro in Kombination mit der relativ einfachen Durchführbarkeit der Isolierung macht diese Zellen zu einem vielseitigen Instrument, um regulatorische Prozesse in der frühen Herzentwicklung untersuchen zu können.

Abstract

(Englisch)

Cardiovascular diseases are the leading death cause worldwide, accounting for 30% of all global deaths. The fact that more people die from cardiovascular diseases annually than from any other cause has led to extensive cardiovascular research in the past. For decades, the heart was believed to be a post-mitotic organ and the inevitable loss of cardiomyocytes after acute myocardial infarction was thought to be irreversible. The recent notion that the heart is capable of intrinsic regeneration via endogenous cardiac precursors has combined the fields of cardiovascular research, developmental and stem cell biology. Various groups have succeeded in the isolation of somatic stem cells from the hearts of different mammalian species, however, so far the obtained cells could not be maintained as self-renewing and phenotypically stable clonal cell lines in vitro. Here we present a simple and robust strategy for the isolation of cardiovascular progenitor cells from both neonatal and adult murine hearts. We use a three component system consisting of somatic heart cells, embryonic stem cells and LIF secreting feeder cells with selectable markers to mimic stem cell niche conditions and foster cardiovascular progenitor cell survival until stable clonal cell lines can be established. We demonstrate that isolated cardiovascular progenitor cells indeed stem from the murine heart and do not arise from cell fusion, transdifferentiation or reprogramming of somatic heart cells. They are capable of self-renewal in a LIF-dependent manner and, in contrast to embryonic stem cells, differentiate preferentially into functional cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells upon LIF deprivation. This indicates a subtle cardiac commitment of these cells, which is consistent with the expression of both stem cell and early mesodermal and cardiac markers in undifferentiated cardiovascular progenitor cells. In addition, using the embryoid body model system we show that cardiovascular progenitor give rise to more functional cardiomyocytes and smooth muscle cells and respond to biochemical induction of cardiac differentiation by cardiogenic small molecules like MK142 or Cardiogenol-C at higher levels compared to embryonic stem cells. We have cultivated cardiovascular progenitor cells for up to 147 passages so far without any phenotypic and karyotypic changes or the loss of differentiation potential. The stability of these cells in vitro along with the feasibility of our isolation method makes them a versatile tool to study regulatory processes in early cardiogenesis.

Autor*innen

Philipp Heher

Haupttitel (Englisch)

A novel strategy for the isolation of cardiovascular progenitor cells from murine hearts

Paralleltitel (Deutsch)

Eine neue Strategie für die Isolierung von Kardiovaskulären Vorläuferzellen aus murinen Herzen

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

128 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Georg Weitzer

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10843243

Utheses ID

21655

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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