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The effect of EWS and its oncogenic derivative EWS-FLl1 on transcriptional and post-transcriptional gene regulation in Ewing sarcoma

Lucia Theresia Riedmann

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Heinrich Kovar

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DOI

10.25365/thesis.24318

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29972.26774.925265-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Ewing Sarkome (ES) sind in 85% der Fälle durch das onkogene Fusionsprotein EWS-FLI1 charakterisiert. Dieses entsteht durch die Fusion zweier Gene, EWS und FLI1, auf Grund einer chromosomalen Translokation. Während FLI1 ein ETS Transkriptionsfaktor ist, gehört EWS zur evolutionär konservierten FET Familie der RNA-bindenden Proteine. Bislang haben sich funktionelle Studien der onkogenen EWS-Fusionsproteine immer auf deren mutmaßliche Rolle als veränderte ETS Transkriptionsfaktoren bezogen. Allerdings werden chimäre FET-Proteine normalerweise gemeinsam mit ihren intakten Gegenstücken exprimiert und Proteininteraktions-Studien haben gezeigt, dass EWS und EWS-FLI1 miteinander interagieren. Folglich ist es denkbar, dass ein Teil der onkogenen Aktivität von EWS-FLI1 in der funktionellen Interferenz mit der normalen Funktion von EWS besteht. Die exakte Rolle von EWS in der transkriptionellen und post-transkriptionellen Genregulation ist jedoch bislang nicht gut definiert. Da FET Proteine mit einer großen Anzahl RNA-Prozessierungsfaktoren assoziiert sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss modulierter EWS-Expression sowohl auf die Genexpression als auch die Exon-Zusammensetzung von Transkripten in ES Zelllinien mittels Affymetrix HuEx-1.0stv2 Arrays untersucht. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene zelluläre Modelle etabliert: In einer einzigartigen ES Zelllinie ohne endogenes EWS wurde stabile EWS-Expression wiederhergestellt (Wiederherstellungs-Modell). Eine andere ES Zelllinie wurde nach stabiler Stilllegung von EWS und induzierbarer, RNAi-vermittelter Suppression von EWS-FLI1 untersucht (Suppressions-Modell). Betreffend differenzieller Expression ganzer Transkripte, konnten mehrere Gene mit EWS-abhängiger Variation des Expressions-Niveaus in beiden zellulären Systemen identifiziert werden. Die differenziellen Genexpressionsmuster lassen sich durch zwei Modelle funktioneller Konkurrenz bzw. Interaktion zwischen EWS und dem Fusionsprotein erklären. Die Gene aus der Überschneidungsmenge der beiden zellulären Modelle konnten dementsprechend anhand ihrer EWS- und EWS-FLI1-abhängigen Expressionsmuster klassifiziert werden. Mittels 5‘-RACE PCR Experimenten wurde die Möglichkeit alternativer Transkriptionsstartpunkt-Selektion in Abhängigkeit von EWS als möglicher Grund veränderter Transkriptstabilität, die die beobachteten differenziellen RNA-Niveaus verursacht, ausgeschlossen. Außerdem konnten signifikante Unterschiede in der Exon-Zusammensetzung mehrerer Gene in beiden zellulären Modellen festgestellt werden. Jedoch war keine Überlappung der beiden Datensätze feststellbar. Diese beobachteten alternativen Splicing-Muster konnten mit Hilfe von RT-qPCR verifiziert werden. Die phänotypische Relevanz von EWS in ES Zellen wurde anhand zweier verschiedener funktioneller Tests untersucht. In Soft-Agar Colony Assays konnte gezeigt werden, dass EWS die Oberflächen-unabhängige Koloniebildung fördert. Proliferations-Versuche hingegen zeigten, dass EWS keinen Effekt auf das Oberflächen-abhängige Zellwachstum hat. Zusammengefasst unterstützen die hier beschriebenen Resultate bereits veröffentlichte Hinweise für eine Beteiligung von EWS an transkriptioneller und post-transkriptioneller Genregulation. Die beobachteten Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Zellmodellen unterstreichen aber den Einfluss des zellulären Hintergrundes auf die EWS Funktion und dessen Interaktion mit EWS-FLI1.

Abstract

(Englisch)

Ewing sarcoma (ES) are characterized in 85% of cases by the expression of the oncogenic fusion protein EWS-FLI1 which results from the fusion of two genes, EWS and FLI1, upon chromosomal translocation. While FLI1 is an ETS transcription factor, EWS belongs to the evolutionarily conserved FET family of RNA-binding proteins. So far, functional studies of oncogenic EWS fusion proteins have concentrated on their presumed role as aberrant ETS transcription factors. However, chimeric FET proteins are usually co-expressed with their intact counterparts and previous protein interaction studies have shown that EWS and EWS-FLI1 interact with each other. Therefore, it is possible that functional interference with normal EWS function accounts for part of the oncogenic activities of EWS-FLI1. However, the role of EWS in post-transcriptional and transcriptional gene regulation is poorly defined. Since FET proteins associate with a number of RNA processing factors, we investigated the influence of modulated EWS expression on genome wide transcript expression and exon composition in ES cell lines using Affymetrix HuEx-1.0stv2 arrays. For that purpose, we established two cellular model systems: a unique ES cell line lacking endogenous EWS was studied upon stable restoration and re-knockdown of EWS expression (restoration model), and an ES cell line with stable EWS knockdown was analyzed upon inducible RNAi-mediated EWS-FLI1 suppression (knockdown model). Regarding differential expression of whole transcripts, a number of genes with expression level variations upon modulated EWS expression were identified in both cellular systems. Differential gene expression in the presence and absence of EWS might be explained by two models of either functional competition or functional interaction between EWS and the fusion gene, and genes from the overlap between the two data sets were classified accordingly depending on their EWS and EWS-FLI1 dependent expression patterns. 5´-RACE PCR experiments excluded the possibility of EWS dependent alternative transcription start site selection as a potential cause of altered transcript stability to account for the observed differential RNA expression effect. In addition, we found significant differences in exon composition of genes in each of the two cellular systems, but almost no overlap between the two models. The observed alternative splicing patterns were verified by RT-qPCR of candidate genes. The phenotypic relevance of EWS expression in ES cells was examined involving two different functional assays. EWS expression was found to improve anchorage-independent growth in soft agar colony formation assays while no significant effect could be detected concerning anchorage-dependent growth in proliferation assays. Taken together, the results described in this thesis are in line with published evidence for an involvement of EWS in transcriptional and post-transcriptional regulation. However, the differences detected between the two cellular model systems emphasize dependence of EWS function and interaction with EWS-FLI1 on the cellular background.

Autor*innen

Lucia Theresia Riedmann

Haupttitel (Englisch)

The effect of EWS and its oncogenic derivative EWS-FLl1 on transcriptional and post-transcriptional gene regulation in Ewing sarcoma

Paralleltitel (Deutsch)

Der Effekt von EWS und seinem Onkogenen Derivativ EWS-FLI1 auf die Transkriptionelle und Post-transkriptionelle Genregulation in Ewing Sarkomen

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

109 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Pierre Aman ,

Christian Seiser

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges ,

42 Biologie > 42.20 Genetik

AC Nummer

AC10725127

Utheses ID

21739

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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Schlagwörter