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A subcellular fractionation that allows the measurement of the proteome and the metabolome
Benedict Dirnberger
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Stefanie Wienkoop
DOI
10.25365/thesis.24653
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29660.74232.503062-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Etablierung von Techniken, die es erlauben auf subzellularer Ebene das Metabolom gemeinsam mit dem Proteom untersuchen zu können, führen zu einem besseren Verständnis des komplexen Zellmetabolismus der Pflanze. Spezielle Methoden, die es vor allem möglich machen, kombinierte Metabolomik und Proteomik auf subzellularer Ebene betreiben zu können, sind ein Engpaß auf dem Gebiet der subzellulären Forschung. Die “Nicht-wässrige Fraktionierung“ wurde als bahnbrechende Technologie entwickelt, die es erlaubt, zelluläre Pflanzengewebe, insbesondere Blätter, in verschiedene Fraktionen zu trennen (Stitt et al. 1989). Sie ist derzeit die einzige Methode, um die Verteilung der Metaboliten in Pflanzengewebe berechnen zu können (Geigenberger et al. 2011). Sie erlaubt die quantitative Bestimmung der Verteilung der Metaboliten in den Chloroplasten beziehungsweise in Zytosol/Mitochondrien und in den Vakuolen mit Hilfe von Messungen der Markerenzymaktivitäten. Diese Markerenzyme sind spezifisch für das jeweilige Zellkompartiment. Marker, welche in verschiedenen Kompartimenten aktiv sind, führen zu Fehlern in der Berechnung. Obgleich etabliert für Metabolomik ist die „Nicht- wässrige Fraktionierung“ bislang nicht für Analysen in der Proteomik verwendet worden. Eine weiterführende Entwicklung dieser Methode für Proteomik auf Basis einer „shotgun“ massenspektroskopischen Analyse ermöglicht nicht nur die Erforschung der subzellulären Lokalisation von Proteinen, sondern zugleich auch das Auffinden neuer Markerenzyme, die für die quantitative Bestimmung der Verteilung der Metaboliten wichtig sind.
Die vorliegende Arbeit bietet erste Einblicke in eine kombinierte Technik der “Nicht-wässrigen Fraktionierung“ zur Untersuchung der Metabolome und Proteome auf subzellulärer Ebene. Ein Hauptaugenmerk liegt auf der Etablierung der “Nicht-wässrigen Fraktionierung“ hin zur Untersuchung des Proteoms eines Pflanzengewebes. Subzelluläre Fraktionierungen eines gradienten wurden für Pflanzengewebe von Arabidopsis thaliana und Medicago truncatula mittels Massenspektroskopie analysiert. Außerdem wurde gezeigt, dass es mit dieser Technik möglich ist, nach verschieden geeigneten Markerenzymen suchen zu können und mit diesen dann die quantitative Bestimmung der Verteilung der Metabolite durchzuführen. Zur Bestimmung der verschiedenen Metabolitkonzentrationen in den neun Fraktionen des gleichen Gradienten wurde eine gaschromatograph- massenspektrometrische Analyse herangezogen. Mit Hilfe der Markerenzyme ist es möglich, die quantitative Verteilung der Metabolite in den Zellkompartimenten bestimmen zu können. Um die Effektivität der “Nicht-wässrigen Fraktionierung“ zu bestimmen wurde diese Fraktionierung verglichen mit anderen bekannten „Percoll gradient“ Extraktions Protokollen.
Durch Weiterentwicklung dieses Verfahrens können neue Türen für wesentliche zusätzliche Fragestellungen geöffnet werden. Eine davon wäre zum Beispiel die Untersuchung der Veränderung des Metaboloms beziehungsweise Proteoms auf subzellulärer Ebene nach geänderten Umweltbedingungen, zum Beispiel unter bestimmten Trockenbedingungen beziehungsweise veränderten Salzkonzentrationen. Der integrative Ansatz der “Nicht-wässrigen Fraktionierung“ wird die absoulte Quantifizierung von Markerenzymen mittels „targeted proteomics“ wie zum Beispiel Mass Western möglich machen (Lehmann et al. 2008). Die absolute Quantifizierung der Markerenzyme wird die Bestimmung der Verteilung der Proteine und Metabolite in den verschienen zellulären Kompartments auf Basis ihrer Konzentration ermöglichen. Meine Arbeit gibt einen kurzen Einblick in die Mass Western Technik für subzellulärer Fraktionierung.
Abstract
(Englisch)
The establishment for an integrative approach for metabolomics and proteomics studies on subcellular level will lead to a more differentiated and comprehensive analysis of the complex plant cell metabolism. Special techniques that enable combined metabolomic and proteomic research on subcellular level are a bottle neck in the field of subcellular research. The non- aqueous fractionation (NAF) was developed as a powerful technique that allows the separation of plant material, especially leaves, into a series of fractions (Stitt et al. 1989). Non- aqueous fractionation is currently the only method that allows calculating the distribution of metabolites in plant tissues (Geigenberger et al. 2011). The determination of the distribution of subcellular metabolites among chloroplast, cytosol/mitochondrion and vacuole is done via marker enzyme activities. These marker enzymes are selective for each compartment. Markers that are shared between compartments could lead to errors in the calculation. Although established for metabolomics, NAF has not been used for proteomic analysis, so far. An adaptation of this technique for proteomic shotgun mass spectrometry based studies will enable the investigation of the subcellular distribution of the proteome and the discovery of novel marker enzymes which are important to determine the quantitative distribution of metabolites across the cellular compartments.
This thesis gives first insights into a combined technique using NAF to investigate the metabolome and the proteome on a subcellular level. The main focus of this study was the prove of concept for applicability of NAF to proteomics. Subcellular fractions of a NAF gradient were analyzed for Arabidopsis thaliana and Medicago truncatula leave tissue using mass spectrometry. Besides these measurements it could be shown that it is possible not only to identify the well known marker enzymes but to also identify new and robust marker enzymes and improve the quantitative determination of the distribution of the metabolites with these new marker enzymes. For analyzing the metabolite concentration in the nine fractions gas chromatography mass spectrometry was used. With the help of the marker enzymes it is possible to define the distribution of the metabolites in the different compartments. To determine efficiency of the NAF, this fractionation has been compared with other well known “percoll gradient” extraction protocols.
The progress of the NAF to a proteomic level opens new doors for further research questions. One of them addresses the changes in the metabolites and proteins under different environmental conditions such as under drought or different salt conditions. The integrative NAF approach will also allow for absolute quantification of marker enzymes using targeted proteomics such as mass western (Lehmann et al. 2008). The absolute quantification of marker enzymes would enable to determine the distribution of the proteins and metabolites in the different compartments on absolute concentration level. My thesis will also show an initial approach to set up specific mass western for subcellular fractionation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
non-aqueous fractionation metabolomics proteomics Arabidopsis Thaliana
Schlagwörter
(Deutsch)
Nicht-wässrige Fraktionierung Metabolomik Proteomik Arabidopsis Thaliana
Autor*innen
Benedict Dirnberger
Haupttitel (Englisch)
A subcellular fractionation that allows the measurement of the proteome and the metabolome
Paralleltitel (Deutsch)
Eine Subzelluläre Fraktionierung zur Messung des Proteoms und des Metaboloms
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
67 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Stefanie Wienkoop
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11138677
Utheses ID
22035
Studienkennzahl
UA | 441 | | |